重組人乳頭瘤病毒蛋白表達的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本領(lǐng)域涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)密碼子優(yōu)化而適于在畢赤 酵母中表達的各種人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1的基因，以及含有該人乳頭瘤病毒主要 衣殼蛋白L1基因的載體，菌株，表達該基因的方法，及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的 一個無包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒。HPV可通過人體間的密切接觸傳播，引起被感染者 的皮膚出現(xiàn)尋常疣和肛門生殖器尖銳濕疣等病變，被列為性傳播疾病。1995年，國際癌癥 研究中心公布的研究結(jié)果證實，HPV與宮頸癌有密切的因果關(guān)系。由此可見，HPV感染已成 為嚴(yán)重危害人類健康的病原體。因此，研制高效、廉價的HPV疫苗，對于預(yù)防女性宮頸癌和 HPV感染所引起的性傳播疾病具有十分重要的意義。
[0003] 目前已經(jīng)確定的HPV型超過100種。采用靈敏的檢測方法，可以從幾乎100%的宮 頸癌患者病變組織中檢測到高危HPV-DNA。根據(jù)HPV亞型與女性生殖道惡性腫瘤的關(guān)系，將 HPV分為低危型和高危型。即￥6、11、34、40、42等型多見于良性宮頸病變?nèi)鐚m頸濕疣及宮頸 上皮輕度不典型性增生病變中，屬HPV低危型；而宮頸上皮重度不典型增生及宮頸癌中以 HPV16、18、31、33、35、39、45,52,58型感染更為多見，這些亞型為高危型。不同人群中一系 列的研究已證實生殖道的HPV16U8型感染與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)，較其他危險因素更 密切。宮頸癌患者中，約50-60%是由HPV16感染引起，HPV18約占14%，HPV45占約8%， HPV31 占約 5%，其余型占 23% (Walboomers JM.et al.J Patholl999;189:12-19)。根據(jù) 2010年世界衛(wèi)生組織WHO的報告，HPV58是中國大陸地區(qū)宮頸癌中HPV檢測率第3位的高危 型別，發(fā)生率為11.7%，屬于在中國發(fā)生率較高的HPV亞型（China Human Papillomavirus and Related Cancers, Fact Sheet2010, WHO / ICO Information Centre on HPV and CervicalCancer, Sep 15,2010)〇
[0004] 宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大婦科惡性腫瘤，全球每年有超過50萬的婦女被 診斷出患有宮頸癌，27萬婦女死于此病，年齡標(biāo)準(zhǔn)化感染率達10. 5%。早在80年代初， Harald zur Hausen就發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV)的感染與宮頸癌 發(fā)病有關(guān)，后續(xù)的大量研究也已證明HPV與宮頸癌及其癌前病變有密切聯(lián)系。到目前為止， 已發(fā)現(xiàn)了百余種HPV基因型，其中約40種可以感染生殖道粘膜。一個正常婦女一生中宮頸 至少感染一種HPV的終生累計概率約為40 %。
[0005] 國內(nèi)目前尚無系統(tǒng)的尖銳濕疣和HPV相關(guān)調(diào)查，但是各地區(qū)的分別調(diào)查基本可以 說明HPV6、11在尖銳濕疣中的重要作用。近期的深圳地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示HPV6、 11型感染者在尖銳濕疣患者中約占80% (數(shù)據(jù)來源：深圳市人民醫(yī)院352例尖銳濕疣患 者生殖道人乳頭狀瘤病毒基因亞型的分布及意義，唐敏；戴勇；呂曉萍；李體遠(yuǎn)；第三軍醫(yī) 大學(xué)學(xué)報，2007年21期）；臨沂地區(qū)的調(diào)查結(jié)果HPV6、11型感染者在尖銳濕疣患者中占 85. 19%，（數(shù)據(jù)來源：108例尖銳濕疣患者HPV的基因分型及臨床分析，熊瑛；社區(qū)醫(yī)學(xué)雜 志，2007年17期）。
[0006] HPV是無包膜二十面體對稱病毒，其病毒基因組DNA為閉合環(huán)狀，長度約 7200_8000bp，由早期編碼區(qū)（early region)、晚期編碼區(qū)（late region)和位于兩者之間 的長調(diào)控區(qū)（long control region)組成。其中晚期編碼區(qū)含兩個開放閱讀框（0RF)，編碼 病毒衣殼蛋白L1和L2。L1蛋白分子量約55kDa，為主要衣殼蛋白，以72個五聚體的形式支 撐整個病毒衣殼結(jié)構(gòu)，在不同型別中氨基酸序列高度保守，能夠刺激機體產(chǎn)生保護性抗體。 L2蛋白分子量較小，多位于L1蛋白內(nèi)部。
[0007] 昆蟲表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、原核表達系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞等多種表達系統(tǒng)都 可以通過單獨表達主要衣殼蛋白L1或聯(lián)合表達L1+L2的方式獲得病毒樣顆粒（VLP)。L1 單獨表達得到的VLP與天然病毒衣殼結(jié)構(gòu)類似，可用于誘導(dǎo)與保護免受病毒侵襲有關(guān)的高 效價病毒中和抗體應(yīng)答。
[0008] 因此，鑒于L1蛋白于不同基因型別內(nèi)部高度保守，并且能夠單獨表達形成VLP，以 L1蛋白作為HPV疫苗研發(fā)的目標(biāo)蛋白具有較高的可行性。不過，以表達重組病毒蛋白得到 的VLP作為HPV疫苗的商業(yè)化開發(fā)與生產(chǎn)需要解決許多技術(shù)問題，其中首先需要解決的技 術(shù)問題就是如何提高重組病毒蛋白的表達水平。而L1蛋白在大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病 毒等表達系統(tǒng)中，往往受到這些生物體內(nèi)氨基酸密碼子使用頻率的限制導(dǎo)致表達水平較低 甚至無表達。如Merck公司的美國專利No. 7,498,036中記載，野生型VLP蛋白在釀酒酵母 中的表達量為35 yg / mg (破菌上清液中的VLP /破菌上清液總蛋白）左右。
[0009] 因此，本領(lǐng)域中需要一種高水平表達基因的方法，所述方法應(yīng)該能夠高水平地、操 作簡便和低成本地表達HPV基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種能夠在畢赤酵母中 表達的 HPV 基因，所述基因具有 SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7，SEQID N0:8，SEQ ID N0:9 或 SEQID N0:10所示的核苷酸序列。
[0011] 利用畢赤酵母作為表達重組蛋白的表達系統(tǒng)，具有表達量高、操作簡便、成本低等 特點，并且相較于更高等的昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞而言更利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。由于 不同物種間氨基酸密碼子使用頻率不一，在利用畢赤酵母表達重組蛋白的時候，往往根據(jù) 目的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化調(diào)整后得到更利于翻譯的DNA序列。因此，本發(fā)明 的經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的HPV基因在畢赤酵母中可以獲得較高的表達水平，更有利于針對 HPV的預(yù)防性疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)。如本申請實施例所示，本發(fā)明的密碼子優(yōu)化過的HPV6， 11，16，18,58基因在畢赤酵母中的表達量分別可最高達約134iig / mg，123iig / mg, 135iig / mg, 125iig / mg和132iig / mg(破菌上清液中的VLP /破菌上清液總蛋白）。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種在畢赤酵母中表達HPV L1基因的方法，包括 下述步驟：
[0013] (1)將本發(fā)明的HPV L1基因分別各自克隆入表達載體中；
[0014] (2)將步驟（1)所得的表達載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株中；
[0015] (3)使用抗生素對步驟（2)所得的轉(zhuǎn)化菌株進行篩選，獲得生長情況最好的一個 或多個菌株；
[0016] (4)通過測試各HPV L1基因的表達量對步驟（3)所得的菌株進行進一步篩選，獲 得表達量最高的一個或多個菌株；
[0017] (5)使用步驟（4)所得的菌株進行表達，分別獲得HPV L1蛋白。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟（1)中所述的表達載體為pPICZaB載 體，并且所述步驟（3)中使用的抗生素為Zeocin。。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟（2)中使用的畢赤酵母菌株為畢赤酵 母X-33菌株。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟（4)中測試HPV L1基因的表達量的操 作是通過Western blot方法進行的。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟（5)中的表達步驟為在發(fā)酵罐中進行 的發(fā)酵步驟。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了含有本發(fā)明的各HPV L1基因的表達載體。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述含有本發(fā)明的各HPV L1基因的表達載體來 源于pPICZaB載體。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了含有本發(fā)明的HPV L1基因或表達載體的畢赤酵母 菌株，所述菌株能夠高水平地表達生產(chǎn)各HPV L1蛋白，更利于針對HPV的預(yù)防性疫苗的研 發(fā)與生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0025] 圖1顯示了 HPV6L1基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。1 :DL5000DNAMarker(Takara公 司）；2 :BstBI+KpnI 雙酶切 pPICZ a B-6L1 樣品 1 ;3 :BstBI+KpnI 雙酶切 pPICZ a B-6L1 樣 品2。
[0026] 圖2顯示了 HPV11L1基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。1 :DL5000DNA Marker(Takara 公司）；2 :BstBI+KpnI 雙酶切 pPICZa B-11L1 樣品 1。
[0027] 圖3顯示了 HPV16L1基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。1 :DL5000DNA Marker(Takara 公司）；2 :pPICZ a B-16L1 樣品 1 ;3 :pPICZ a B-16L1 樣品 2 ;4 :BstBI+KpnI 雙酶切 pPICZ a B-16L1 樣品 1 ;BstBI+KpnI 雙酶切 pPICZ a B-16L1 樣品 2。
[0028] 圖4顯示了HPV18L1基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。1 :DL5000DNA Marker(Takara 公司）；2 :BstBI+KpnI雙酶切pPICZa B-18L1樣品。
[0029] 圖5顯示了 HPV58L1基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。1 :BstBI+KpnI雙酶切 pPICZ a B-58L1 樣品；2:DL5000DNAMarker (Takara公司）。
[0030] 圖6顯示了破菌后的HPV6L1上清液Western-blot鑒定。1-8 :重組表達菌株；9: PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 :空宿主菌。
[0031] 圖7顯示了破菌后的HPV11L1上清液Western-blot鑒定。1-8 :重組表達菌株；9: PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 :空宿主菌。
[0032] 圖8顯示了破菌后的HPV16L1上清液Western-blot鑒定。1-8 :重組表達菌株；9: PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 :空宿主菌。
[0033] 圖 9 顯示了破菌后的HPV18L1上清液Western-blot鑒定。1 :PageRuler Prestained Protein Ladder ;2_1