氣道上皮靶向定時(shí)剔除整合素β4動(dòng)物模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及氣道上皮靶向定時(shí)剔除整合素0 4動(dòng)物模型 的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 哮喘患者的氣道上皮存在著典型的組織結(jié)構(gòu)破壞和功能損傷：氣道上皮細(xì)胞松 動(dòng)、脫落，對(duì)外界刺激的高敏感性和不正常的損傷修復(fù)及上皮結(jié)構(gòu)重構(gòu)。已知上皮細(xì)通過表 達(dá)不同類型的粘附分子實(shí)現(xiàn)"粘附"和"錨定"是上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的先決條件，粘附分子 的平衡表達(dá)對(duì)于維持氣道上皮功能穩(wěn)態(tài)有重要意義。
[0003] 整合素0 4在維持氣道上皮的結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)缺陷可能參 與哮喘易感性構(gòu)成。但是，要確認(rèn)整合素0 4表達(dá)缺陷與哮喘易感性的直接因果關(guān)系證據(jù)， 需要在整體動(dòng)物水平干擾整合素0 4在氣道上皮的表達(dá)，復(fù)制出哮喘或氣道高反應(yīng)動(dòng)物模 型?，F(xiàn)有技術(shù)主要是全基因組整合素0 4敲除方法。全基因組整合素0 4敲除方法存在許 多缺陷，不能有效地觀察整合素0 4在特定組織的的生理功能特性及其表達(dá)缺陷與哮喘發(fā) 病易感性的關(guān)系。具體而言，主要的缺點(diǎn)包括：1)致死效應(yīng)：很多基因完全剔除會(huì)導(dǎo)致小鼠 胚胎早期死亡，無法對(duì)突變小鼠胚胎進(jìn)行分析研宄；2)所產(chǎn)生的表型不知道是由哪一類細(xì) 胞引起的；3)不可控性：由于陽性篩選標(biāo)記基因存在強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，篩選標(biāo)記基因的 保留會(huì)導(dǎo)致干擾相鄰基因的表達(dá)?？傊?，由于完全的基因剔除使小鼠從受精卵細(xì)胞開始就 實(shí)現(xiàn)所有細(xì)胞的基因缺失或突變，這樣很多對(duì)于發(fā)育相當(dāng)重要的基因剔除時(shí)會(huì)引起胚胎早 期死亡或嚴(yán)重的發(fā)育缺陷使突變無法傳代，不能實(shí)現(xiàn)在小鼠的各個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行基因的 功能分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種氣道上皮靶向定時(shí)剔除整合素M動(dòng) 物模型的構(gòu)建方法，其特征在于實(shí)現(xiàn)一個(gè)基因在局部靶向器官的可調(diào)性性基因剔除。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述氣道上皮靶向定時(shí)剔除整合素e 4動(dòng)物模型的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0007] (1)構(gòu)建出以整合素0 4為目的基因的整合素Mfloxed小鼠：選擇小鼠基因打 靶 PGEM5 載體（GenBank:DQ778470. 1)，以小鼠整合素 0 4 基因（Gene ID:3691)第 5、6 外 顯子作為條件性敲除的目的片段，在PGEM5載體兩側(cè)插入LoxP位點(diǎn)；以FVB品系小鼠Es細(xì) 胞基因組DNA為模板分步擴(kuò)增包括整合素0 4第5、6外顯子和上游同源臂在內(nèi)的3. lkb基 因片段，以及下游同源臂4. 9kb基因片段；將擴(kuò)增所得基因片段酶切后與pGEM5載體連接， 獲得小鼠整合素0 4條件基因打靶載體；將小鼠整合素0 4條件基因打靶載體轉(zhuǎn)染小鼠ES 細(xì)胞，用PCR擴(kuò)增法，特異性探針雜交法及多酶切圖譜法篩選ES細(xì)胞中的雜合子，將ES雜 合子（+/_)注入到宿主囊胚中，將獲得的陽性胚胎注入到假孕鼠子宮中，通過DNA印跡雜 交及RNA印跡雜交篩選帶有小鼠整合素0 4條件基因打靶載體基因的子代小鼠；再通過特 異性探針雜交法，DNA印跡雜交，RNA印記雜交篩選鑒定雜交獲得的整合素fMfloxed小鼠； 其中所述的PCR擴(kuò)增法、特異性探針雜交法、多酶切圖譜法、DNA印跡雜交法、RNA印跡雜交 法均為本領(lǐng)域常規(guī)方法；
[0008] (2)構(gòu)建 CCSP-rtTAline 和（otet)-Cre line 兩種工具小鼠；
[0009] (3)將 CCSP-rtTAline 和（otet)-Cre line 兩種小鼠雜交，建立 Cre-CCSP-(otet) 雙轉(zhuǎn)基因小鼠品系；
[0010] (4)用Cre-CCSP-(otet)小鼠與整合素0 4floxed小鼠雜交，建立 Cre-CCSP-(otet)-整合素0 4floxed三重雜交小鼠；
[0011] (5)將Cre-CCSP-(otet)-整合素0 4floxed三重雜交小鼠用多西環(huán)素進(jìn)行誘導(dǎo)， 腹腔注射多西環(huán)素，所述多西環(huán)素的用量為〇. lmg/g，其中mg是多西環(huán)素的重量單位，g是 小鼠體重的單位，注射多西環(huán)素15天后得到氣道上皮靶向定時(shí)剔除整合素0 4動(dòng)物模型。
[0012] 以上步驟中，CCSP-rtTAline和（otet)-Cre line兩種工具小鼠的構(gòu)建方法，屬于 業(yè)界常用方法。小鼠雜交及多西環(huán)素誘導(dǎo)，也屬于比較常用的手段。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（1)詳細(xì)過程如下：選擇小鼠基因打靶pGEM5載體，以小鼠整合素 0 4基因第5、6外顯子作為條件性敲除的目的片段，在pGEM5載體兩側(cè)重組插入LoxP片 段，剔除5、6號(hào)外顯子后整合素04基因沒有編碼蛋白的起始位點(diǎn)，翻譯不能完成。運(yùn) 用LA-PCR技術(shù)，以FVB品系小鼠ES細(xì)胞（embryonic stem cell，胚胎干細(xì)胞）基因 組DNA為模板分步擴(kuò)增包括整合素0 4的兩端攜帶Lox位點(diǎn)第5、6外顯子（引物序列： 5，-GCCTCTATGGACACCAGG-3,〈SEQIDN0.1〉和 5，-GACGCTGACTTTGTCCACAAACTTTCC-3' 〈SEQ ID NO. 2>);將擴(kuò)增所得基因片段酶切后與pGEM5載體連接，獲得小鼠整合素0 4條件 基因打靶載體。
[0014] 體外分離培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞。將小鼠整合素0 4條件基因打靶載體通過電穿孔法轉(zhuǎn) 染小鼠 ES 細(xì)胞。用 PCR 擴(kuò)增法（引物序列 5' -CTCACTGTATTAAGCGGAC-3'〈SEQ ID NO. 3> 和5' -AAGGGCTGCGGCTCAACCHy〈SEQ IDN0. 4>)，特異性探針雜交法及多酶切圖譜法篩選 ES細(xì)胞中的雜合子，將ES雜合子（+/-)注入到宿主囊胚中。將10-20個(gè)胚胎注入到假孕 鼠子宮中，通過DNA印跡雜交及RNA印跡雜交篩選帶有小鼠整合素0 4條件基因打靶載體 基因的子代小鼠。通過特異性探針雜交法，DNA印跡雜交，RNA印記雜交篩選鑒定雜交整合 素 |3 4floxed 小鼠。
[0015] 下面結(jié)合原理對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0016] 基本的技術(shù)思路：Cre LoxP與基因打靶技術(shù)系統(tǒng)能克服傳統(tǒng)基因打靶的局限性。 該系統(tǒng)包括Cre重組酶和loxP位點(diǎn)兩部分。Cre重組酶是由Sternberg等于1981年從P1 噬菌體中發(fā)現(xiàn)的，是一種編碼38KDa蛋白質(zhì)產(chǎn)物的位點(diǎn)特異性重組酶，它能夠識(shí)別34bp 的LoxP序列并介導(dǎo)2個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的高精確的特異重組，不需要其他因素輔助Cre重 組酶可識(shí)別LoxP位點(diǎn)，切除或置換兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的DNA片段。利用Cre重組酶介導(dǎo)的 LoxP位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，對(duì)基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的"按鈕"，從而對(duì)基 因修飾的范圍和時(shí)間處于實(shí)現(xiàn)可控狀態(tài)。通過給Cre重組酶基因選擇適當(dāng)?shù)慕M織特異性 啟動(dòng)子，控制Cre重組酶基因在特定組織細(xì)胞中表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)Cre酶-loxP基因打靶系 統(tǒng)的組織特異性。由CCSP啟動(dòng)子在氣道上皮細(xì)胞激活的一種新型Cre系統(tǒng)。在多西環(huán)素 誘導(dǎo)后，成功實(shí)現(xiàn)在氣道上皮所有細(xì)胞中敲除integrine 4,該小鼠模型為進(jìn)一步確切研宄 integrin |3 4基因在氣道上皮中功能提供了理想工具，它將進(jìn)一步闡明integrin |3 4在哮 喘發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制，為研宄表觀遺傳學(xué)提供了新的線索，為研宄哮喘靶向治療提 供了新的工具。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0018] 第一，首次在動(dòng)物整體水平實(shí)現(xiàn)整合素0 4的表達(dá)剔除。這對(duì)推進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的研 宄，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。
[0019] 第二，該方法的實(shí)驗(yàn)小鼠存活率高。本專利并非直接針對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行基因敲除， 而是通過多代雜交，最終雜交出的小鼠具有理想的特性。這時(shí)，小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中可以得到 很好的存活。
[0020] 第三，該方法對(duì)整合素e 4的表達(dá)剔除是可誘導(dǎo)可逆轉(zhuǎn)的，可控性好。通過多西四 環(huán)素誘導(dǎo)后，可實(shí)現(xiàn)表達(dá)剔除；一旦停止誘導(dǎo)，數(shù)日后，整合素0 4的表達(dá)又可以恢復(fù)。這種 靈活性，使得我們?cè)趧?dòng)物整體發(fā)育的各個(gè)階段，均可觀察整合素0 4與氣道上皮功能穩(wěn)態(tài)、 哮喘易感性等之間的關(guān)系。
[0021] 總之，本發(fā)明在整體動(dòng)物水平干擾整合素|3 4 (integrin beta 4, ITGB4)在氣道上 皮的表達(dá)，得到調(diào)控性好的哮喘或氣道高反應(yīng)動(dòng)物模型。其主要功能是實(shí)現(xiàn)在氣道上皮細(xì) 胞中敲除整合素0 4,該小鼠模型為進(jìn)一步確切研宄整合素0 4基因在氣道上皮中功能提 供了理想工具，為研宄哮喘靶向治療提供了新的動(dòng)物模型。
[0022] 說明書附圖
[0023] 圖1A :原代分離氣道上皮細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)整合素4m