人胚腎細(xì)胞hek293t電轉(zhuǎn)染的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人胚腎細(xì)胞HEK293T是一個常用的研宄表達外源基因的細(xì)胞株，其極少表達細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體，且比較容易轉(zhuǎn)染。HEK293T細(xì)胞由293細(xì)胞派生，表達SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞系，因其較高的轉(zhuǎn)染效率而被廣泛應(yīng)用于瞬時轉(zhuǎn)染，過表達各種目標(biāo)蛋白，或是用以包裝病毒。
[0003]HEK293T細(xì)胞常采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，操作周期通常為兩天，但是，脂質(zhì)體試劑本身頗為昂貴，且?guī)в卸拘?，影響?xì)胞的正常生長。病毒轉(zhuǎn)染是另一種常用的HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，其制備周期更長，通常為1-2個月，且價格不菲，因改造后病毒仍然具有侵染性，操作起來頗為繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低廉、操作簡便、周期較短的人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法，采用低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對人胚腎細(xì)胞HEK293T進行一次放電；電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為90?280m0smol/kg，一次放電的電壓為130?810V，持續(xù)時間為45?75 μ s (微秒)。
[0006]電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為200?280m0smol/kg。
[0007]一次放電的電壓為100?200V或200?300V或300?400V或400?600V，持續(xù)時間為75 μ S。
[0008]電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為250m0smol/kg，一次放電的電壓為130V或260V或390V或520V，持續(xù)時間為75 μ S。
[0009]電轉(zhuǎn)染緩沖液由低滲透壓溶液和等滲透壓溶液配制而成；低滲透壓溶液組成為KCl25mM、KH2PO40.3mM、KHPO 0.85mM、肌醇 90m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?
3.8mS/cm);等滲透壓溶液組成為 KCl 25mM,KH2PO4 0.3mM、K2HPO4 0.85mM、肌醇 280m0smol/kg, ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
[0010]電轉(zhuǎn)染是一種備受關(guān)注的轉(zhuǎn)基因方法，其成本低廉，只需要普通緩沖鹽溶液即可，周期短，通常只需一天，操作簡便，不會對細(xì)胞產(chǎn)生強大的毒副作用。針對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)染的周期長、成本高、操作繁瑣的問題，發(fā)明人結(jié)合電轉(zhuǎn)染的上述優(yōu)點，建立了一種人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法，該法主要采用低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對人胚腎細(xì)胞HEK293T進行一次放電，通過高壓脈沖電場和低滲透壓組合，使得細(xì)胞體積增大，脈沖電場更容易擊穿細(xì)胞膜，增加膜穿孔數(shù)量，外源分子更容易進入細(xì)胞質(zhì)中，從而提高電轉(zhuǎn)效率。實際測試表明，應(yīng)用本發(fā)明HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pmaxGFP(綠色熒光蛋白)細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果轉(zhuǎn)染效率達到60%左右。本發(fā)明可以縮短周期，降低成本，減少操作復(fù)雜性，為HEK293T細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因研宄提供關(guān)鍵的技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0011]圖1是傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0012]圖2是傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞不加質(zhì)粒的陰性對照的熒光顯微鏡圖。
[0013]圖3是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(130V)HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0014]圖4是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(260V)HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0015]圖5是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(390V)HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0016]圖6是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(520V)HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0017]圖7是各種不同條件下轉(zhuǎn)染進gfp的細(xì)胞占總細(xì)胞的比例的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0018]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和本發(fā)明電轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率進行對比，同時設(shè)置不轉(zhuǎn)質(zhì)粒的組作為陰性對照。
[0019]一、人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法
[0020]試驗方法:用人胚腎細(xì)胞HEK293T通過本發(fā)明電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染AMAXA公司的貨號Svpa10i的PmaXGFP(綠色熒光蛋白)質(zhì)粒，采用熒光顯微鏡拍照計算發(fā)綠色熒光數(shù)目的細(xì)胞以分析轉(zhuǎn)染效率。試驗中包括了對細(xì)胞實施四種不同電壓，相同滲透壓的緩沖液以及相同脈沖時長的放電時間。
[0021]試驗設(shè)備:型號eppendorf multiporator，貨號 4308CG831520。
[0022]電轉(zhuǎn)染方法:采用低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液(250m0smol/kg)，對人胚腎細(xì)胞HEK293T進行一次放電；電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為250m0smol/kg，一次放電的電壓分別為130V、260V、390V、520V，持續(xù)時間為75 μ s。其中，低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液采用的低滲透壓溶液和等滲透壓溶液混合配制成滲透壓為250m0smOl/kg的電轉(zhuǎn)緩沖液。低滲透壓溶液(KC1，25mM ；KH2PO4,0.3mM ；KHP0 0.85mM ；肌醇 90m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm)，等滲透壓溶液(KC1，25mM ；KH2PO4,0.3mM ；Κ2ΗΡ04 0.85mM ;肌醇280m0smol/kg，pH7.1?7.3，電導(dǎo)率，25度3.2?3.8mS/cm)，低滲透壓溶液取1.6ml，等滲透壓溶液取8.4ml，混合均勻后便是250m0smol/kg的電轉(zhuǎn)緩沖液。
[0023]具體試驗步驟如下:
[0024]指數(shù)時期收集細(xì)胞，以滲透壓為250m0smOl/kg的低滲緩沖液稀釋細(xì)胞，并加入質(zhì)粒，要求細(xì)胞終密度為2xl06cells/ml，質(zhì)粒終濃度為20 μ g/ml ;分裝400 μ I至直徑為2mm的電轉(zhuǎn)杯后，施加電壓；
[0025]第一次條件為:電壓130V，滲透壓250m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0026]第二次條件為:電壓260V，滲透壓250m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0027]第三次條件為:電壓390V，滲透壓250m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0028]第四次條件為:電壓520V，滲透壓250m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ S。
[0029]二、人胚腎細(xì)胞ΗΕΚ293Τ脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法
[0030]將I μ g的質(zhì)粒和I μ I的脂質(zhì)體分別加入50 μ I的optin-DMEM培養(yǎng)基中，靜置5min ;混合均勻后靜置20min，然后加入到孔板中；用optin-DMEM培養(yǎng)基補足剩余的培養(yǎng)基。
[0031]三、實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果
[0032]如圖1至7所示，傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率在60%左右，而采用本發(fā)明方法隨著電壓的增高，HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率呈梯度增高趨勢，130V時達到4%左右，260V時達到10%左右，390V時達到40%左右，520V時達到65%左右，與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率接近。
[0033]通過對比數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明通過高壓脈沖電場和低滲透壓組合的方式，在對細(xì)胞施加不同電壓后，外源分子進入細(xì)胞質(zhì)的數(shù)量呈遞增趨勢，在520V的條件下，HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pmax(綠色熒光蛋白)細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果的轉(zhuǎn)染效率和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染接近，達到60%左右，成本低廉、操作簡便、周期較短，可為該細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因研宄提供關(guān)鍵的技術(shù)支持。
【主權(quán)項】
1.一種人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于采用低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對人胚腎細(xì)胞HEK293T進行一次放電；所述電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為90?280m0smol/kg，一次放電的電壓為130?810V，持續(xù)時間為45?75 μ S。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚腎細(xì)胞ΗΕΚ293Τ電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為200?280m0smol/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述一次放電的電壓為100?200V或200?300V或300?400V或400?600V，持續(xù)時間為75 μ S。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人胚腎細(xì)胞ΗΕΚ293Τ電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為250m0smol/kg，一次放電的電壓為130V或260V或390V或520V，持續(xù)時間為75 μ S。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人胚腎細(xì)胞ΗΕΚ293Τ電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述電轉(zhuǎn)染緩沖液由低滲透壓溶液和等滲透壓溶液配制而成；所述低滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、KHP0 0.85mM、肌醇 90m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm);所述等滲透壓溶液組成為 KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、K2HPO4 0.85mM、肌醇 280m0smol/kg, ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人胚腎細(xì)胞HEK293T電轉(zhuǎn)染的方法，該法主要采用低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對人胚腎細(xì)胞HEK293T進行一次放電，通過高壓脈沖電場和低滲透壓組合，使得細(xì)胞體積增大，秒沖電場更容易擊穿細(xì)胞膜，增加膜穿孔數(shù)量，外源分子更容易進入細(xì)胞質(zhì)中，從而提高電轉(zhuǎn)效率。實際測試表明，應(yīng)用本發(fā)明HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pmaxGFP(綠色熒光蛋白)細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果轉(zhuǎn)染效率達到60％左右。本發(fā)明可以縮短周期，降低成本，減少操作復(fù)雜性，為HEK293T細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因研究提供關(guān)鍵的技術(shù)支持。
【IPC分類】C12N15-87
【公開號】CN104846016
【申請?zhí)枴緾N201510277504
【發(fā)明人】周磊, 李強, 李一星
【申請人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月27日