一種基于順序超聲強(qiáng)化酶解制備谷朊蛋白降血壓肽的方法
【專利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特指采用順序三頻超聲波預(yù)處理谷朊蛋白原料，再利用酶解方法制備谷朊蛋白降血壓肽的一種技術(shù)。
[0002]技術(shù)背景:
小麥谷朊蛋白是小麥淀粉加工的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)75-80%，氨基酸組成均衡齊全，是營(yíng)養(yǎng)豐富、物美價(jià)廉的植物性高蛋白聚合物。我國(guó)的小麥谷朊蛋白年產(chǎn)量大約60多萬(wàn)噸，目前主要作為面粉品質(zhì)改良劑、飼料粘結(jié)劑、營(yíng)養(yǎng)添加劑等用于食品和飼料工業(yè)。最新研宄發(fā)現(xiàn)，谷朊蛋白作為一種非常有潛力的制備生物活性肽的植物蛋白源，其酶解產(chǎn)物可通過(guò)顯著地抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性，而達(dá)到降低血壓的目的。然而，由于谷朊蛋白疏水性氨基酸含量(主要含Pro、Gln、Leu, Ala含量較高)溶解性較差，分散性差，造成谷朊蛋白不能與酶充分的結(jié)合，酶解效率較低。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要由其結(jié)構(gòu)決定，改性是改善或加強(qiáng)某些食物蛋白功能性質(zhì)的有效方法。超聲預(yù)處理蛋白底物可通過(guò)改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白分子顆粒大小，以及分子之間結(jié)合的緊密程度而改善谷朊蛋白原料的酶解特性，提高產(chǎn)品活性。然而，超聲處理時(shí)間和工作模式直接影響到蛋白結(jié)構(gòu)的變化程度，這種變化與其酶解特性的改善和生物活性的提高密切相關(guān)。
[0003]研宄發(fā)現(xiàn)，雙頻或者多頻超聲組合福射對(duì)聲化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)額的提高具有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)，雙頻或者多頻超聲同時(shí)輻射的合效應(yīng)均明顯大于各頻率超聲單獨(dú)輻射效應(yīng)之和。例如，28 kHz與1.7 MHz組合的雙頻超聲組合的雙頻超聲組合輻射，當(dāng)取1.7 MHz超聲強(qiáng)度大于3 W/cm2時(shí)，其合效應(yīng)約為單獨(dú)效應(yīng)之和的1.5倍；當(dāng)1.7 MHz改為1.06 MHz或0.87MHz時(shí)，其合效應(yīng)可接近單獨(dú)效應(yīng)之和的2倍。在雙頻正交輻射的甚礎(chǔ)上加入一束低頻率的超聲構(gòu)成三頻正交輻照，可使其聲化學(xué)產(chǎn)額得到更大的提高，三者合作用結(jié)果大約為三者分別輻照產(chǎn)額之和的1.4 - 1.8倍。《現(xiàn)代食品科技》(2014,30 (3):23-26)發(fā)表的“不同頻率超聲對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響”一文，以鰱魚為原料，采用單頻、雙頻和三頻超聲分別處理鰱魚肌原纖維蛋白，研宄不同頻率超聲處理對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性和表面巰基含量的影響。發(fā)現(xiàn)與未超聲的樣品對(duì)比，經(jīng)三頻超聲處理10 min、單頻超聲處理15 min后蛋白的表面疏水性分別提高了 65.34%，56.88%，蛋白表面巰基含量分別提高了 13.32%，11.19%。雙頻超聲對(duì)蛋白表面疏水性和表面巰基的影響作用介于單頻和三頻超聲處理的之間。這說(shuō)明三頻超聲在蛋白質(zhì)改性方面也就用明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0004]現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)多頻超聲的研宄大多是以同步多頻的工作模式下，利用多頻超聲波峰峰疊加的效應(yīng)，提高超聲波的處理效果。這種效果是在多個(gè)頻率的超聲波發(fā)生器同時(shí)工作同時(shí)發(fā)出超聲波的情況下發(fā)生的，構(gòu)成的合成波譜非常復(fù)雜，會(huì)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生不同程度的峰峰相加和峰峰相消。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是本專利采用較低功率的順序三頻超聲設(shè)備對(duì)谷朊蛋白進(jìn)行預(yù)處理，旨在提高谷朊蛋白的酶解產(chǎn)物的降血壓活性，縮短酶解時(shí)間，并且降低能耗。開發(fā)一種具有良好療效的，安全的，價(jià)格合理的食物蛋白源的降血壓活性肽。本發(fā)明上述目的是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的:
先對(duì)蛋白溶液進(jìn)行超聲預(yù)處理，再進(jìn)行酶解反應(yīng)。具體技術(shù)方案是一種基于順序超聲強(qiáng)化酶解制備谷朊蛋白降血壓肽的方法，按照下述步驟進(jìn)行:(1)將谷朊粉配制成質(zhì)量濃度為3% (W/W)的懸浮液，施加超聲處理，其中順序三頻超聲頻率為:20 KHz,28 KHz,35KHz ;三頻超聲時(shí)間分別為20s、20s、20s ;超聲功率為16.67 W/L，預(yù)處理時(shí)間10-60 min。
(2)加蛋白酶酶解:加3800 U/g堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中保持PH 9.0，溫度50 °C。酶解時(shí)間30 min, 100°C下滅酶10 min, 12000 r/min下離心10 min,收集上清液，即可得到蛋白降血壓肽的提取液。
[0006]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明采用超聲預(yù)處理原料蛋白對(duì)超聲作用后酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性進(jìn)行了研宄。經(jīng)過(guò)三頻超聲預(yù)處理后，改善了酶解效果，提高了酶解產(chǎn)物的活性，并且與原有的超聲處理方式相比降低了能耗。酶解液的ACE抑制率活性提高13%?20%。能耗降低了 3~53.75倍。
[0007]下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0008]【附圖說(shuō)明】:
圖1為本發(fā)明使用的順序三頻超聲預(yù)處理谷朊蛋白的設(shè)備圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]圖1為本發(fā)明使用的順序三頻超聲預(yù)處理谷朊蛋白的設(shè)備圖，為江蘇大學(xué)自主研制。超聲發(fā)生器9、10、11能發(fā)出20、28、35 kHz的超聲波，單臺(tái)超聲波發(fā)生器功率為100 W。超聲池4中內(nèi)壁豎直放置超聲波振板，通過(guò)超聲波發(fā)生器9、10、11分別控制超聲波振板1、2,3；電腦控制器8設(shè)定超聲波各參數(shù)后，控制超聲波發(fā)生器9、10、11，發(fā)出符合要求的超聲波；5為本發(fā)明中設(shè)備的恒溫水浴池，通過(guò)溫度計(jì)6實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度，并根據(jù)工作需要調(diào)節(jié)介質(zhì)溫度；將需要處理的液原料通過(guò)蠕動(dòng)泵7泵入超聲池4中進(jìn)行超聲波處理。
[0010]人體中過(guò)多的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是引起血壓升高的重要原因之一。因此本發(fā)明以酶解產(chǎn)物對(duì)ACE的抑制率評(píng)價(jià)其降血壓活性。酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的測(cè)定按照文獻(xiàn) “J.Jia, H.Ma, ff.Zhao, The use of ultrasound for enzymatic preparat1nof ACE-1nhibitory peptides from wheat germ protein, Food Chemistry.119 (2010)336-342.”的方法進(jìn)行，以馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hippury1-His-Leu，HHL)作為ACE催化的底物，研宄其吸光度的變化，利用高效液相色譜法測(cè)定。
[0011]對(duì)照例:
(I)配制2% (W/W)的谷朊蛋白懸浮液500 mL，放入帶轉(zhuǎn)子的30攝氏度恒溫水浴鍋中攪拌30min，加入3800 U/g (E/S)堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中保持pH 9.0，溫度50°C，酶解30 min，之后沸水浴滅酶lOmin，12000 r/min下離心10 min，收集上清液，稀釋2倍后測(cè)定ACE抑制活性。經(jīng)過(guò)測(cè)定，谷朊蛋白酶解產(chǎn)物稀釋液的ACE抑制率為64.957%。
[0012](2)配制3% (W/W)的谷朊蛋白懸浮液500 mL，放入帶轉(zhuǎn)子的20攝氏度恒溫水浴鍋中攪拌30min，加入3800 U/g (E/S)堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過(guò)程中保持pH 9.0，溫度50°C，酶解30 min，之后沸水浴滅酶lOmin，1200