一種足分支菌病診斷用培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種足分支菌病診斷用培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 足分枝菌?。╩ycetoma)，又稱足菌病、足菌腫，系皮膚和皮下組織的一種慢性化膿 性肉芽腫性疾病，伴有瘺管形成和流出帶有顆粒的膿液。足菌腫好發(fā)足部，其癥狀為丘瘆、 膿皰或結(jié)節(jié)，重復(fù)結(jié)節(jié)、化膿和纖維化。其致病病原體為兩大類：放線菌屬和真菌菌屬，而放 線菌性足菌腫多由奴卡菌屬引發(fā)。該病的治療需要根據(jù)菌屬不同進(jìn)行針對性的抗菌或者抗 真菌治療。
[0003] 該病臨床診斷簡單，但是菌屬鑒別非常困難。目前對于諾卡氏菌屬診斷的金標(biāo)準(zhǔn) 是PCR鑒定，但并不是所有的臨床醫(yī)院都具有分子生物實(shí)驗(yàn)室，因此臨床診斷多依據(jù)細(xì)菌 培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基多為普通血瓊脂培養(yǎng)板（BAP)，由于奴卡菌屬屬于苛養(yǎng)菌，即對生長環(huán) 境、營養(yǎng)要求較苛刻的細(xì)菌，在普通環(huán)境中不能或難以生長，需要培養(yǎng)96小時(shí)方可有陽性 表現(xiàn)，1周左右方能較準(zhǔn)確地做出鑒定，結(jié)果延誤時(shí)間，甚至導(dǎo)致患者被迫截肢或出現(xiàn)肺腦 轉(zhuǎn)移。
[0004] 此外，對于混合感染或者標(biāo)本被真菌污染時(shí)，由于奴卡菌屬的苛養(yǎng)屬性，混入的真 菌在目前的培養(yǎng)基上比奴卡菌生長更快，很快就覆蓋了培養(yǎng)基，導(dǎo)致奴卡菌屬無法生長，陽 性率低。對于混合感染的漏檢率高達(dá)61~70%。因此作為基層醫(yī)院確診唯一依據(jù)的臨床細(xì) 菌檢查的正確與快速鑒定極為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠確保奴卡菌陽性檢 出率的足分支菌病診斷用培養(yǎng)基。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是：一種足分支菌病診斷用培養(yǎng)基，其特征 在，每升中含有牛肝粉10. 〇g ;麥芽浸粉2. 0g ;酵母浸出粉5. 0g ;氯化鈉5. 0g ;磷酸氫二鈉 3. 0g ;瓊脂15. 0g ;焦磷酸鐵0. lg ;乳酸鈣0. 05g ;萘啶酮酸0. 05g ;毛子草酮0. 001g ;維生 素I 0. lg ;無菌脫纖維綿羊血100ml ;;蒸餾水加至1000ml。
[0007] 上述培養(yǎng)基的制備方法為：稱取牛肝粉；麥芽浸粉；酵母浸出粉；氯化鈉；磷酸 氫二鈉；瓊脂；焦磷酸鐵；乳酸鈣；毛子草酮混勻蒸餾水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻 到45°C，加入滅菌萘啶酮酸；滅菌維生素K 1;無菌脫纖維綿羊血混勻，滅菌蒸餾水定容到 1000ml后分裝。
[0008] 其中：所述的牛肝粉、麥芽浸粉提供碳源、氮源，酵母浸出粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、 多肽、核苷酸、維生素、生長因子、微量元素等營養(yǎng)成分，為微生物提供均衡營養(yǎng)，這些物質(zhì) 對促進(jìn)奴卡菌的繁殖和生長都是很重要的因素；氯化鈉維持均衡的滲透壓；磷酸氫二鈉為 緩沖劑；瓊脂為培養(yǎng)基的凝固劑；焦磷酸鐵為營養(yǎng)劑，為奴卡菌繁殖生長提供必需的鐵元 素，且該濃度下，由于焦磷酸鐵的參與，導(dǎo)致真菌生長不良；乳酸鈣除了做營養(yǎng)增強(qiáng)劑外，還 可以抑制革蘭氏陽性菌生長；萘啶酮酸抑制革蘭氏陰性菌的生長；毛子草酮（2-Ethoxymet hylene-3, 5-dihydroxy-y-pyrone)，實(shí)驗(yàn)室研宄表明毛子草酮可以抑制葡萄球菌、鏈球菌、 變形桿菌、腸炎桿菌、多種真菌等雜菌的生長，但該濃度下由于對諾卡氏菌屬無抗菌抑菌作 用，因此提高了奴卡菌的分離率。通過實(shí)驗(yàn)將同一奴卡菌接種到2個(gè)BAP培養(yǎng)基上，其中一 個(gè)BAP培養(yǎng)基添加0. 1%滅菌維生素匕于37°C下培養(yǎng)，48小時(shí)后觀察菌株，發(fā)現(xiàn)添加維生素 匕的BAP培養(yǎng)基有小的奴卡菌菌落，沒有添加維生素k :的BAP培養(yǎng)基未發(fā)現(xiàn)奴卡菌菌落，維 生素h促進(jìn)細(xì)胞生長、分化，是奴卡菌的生長促進(jìn)因子，有助于縮短培養(yǎng)時(shí)間；無菌脫纖維 綿羊血提供能量環(huán)境；酪蛋白磷酸肽為激活劑，可以促進(jìn)奴卡菌對鐵元素、鈣元素的攝??； 天冬酰胺為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，促進(jìn)奴卡菌對氨基酸的攝?。簧攸S為玄參科植物生地黃的新鮮 或干燥塊根，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研宄表明，生地黃根莖中含有20多種苷類；8種糖類；20余種氨基酸 和20余種無機(jī)元素，生地黃水提液是良好的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，并且有抑制金黃色葡萄球菌生長 的作用。
[0009] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、奴卡菌分離率高的特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下結(jié)合實(shí)際情況，對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0011] 實(shí)施例1，配方為：牛肝粉l〇. 〇g ;麥芽浸粉2. 0g ;酵母浸出粉5. 0g ;氯化鈉5. 0g ; 磷酸氫二鈉3. 0g ;瓊脂15. 0g ;焦磷酸鐵0. lg ;乳酸鈣0. 05g ;萘啶酮酸0. 05g ;毛子草酮 0. 001g ;維生素& 0. lg ;無菌脫纖維綿羊血100ml ;;蒸餾水加至1000ml。制備方法稱取 牛肝粉；麥芽浸粉；酵母浸出粉；氯化鈉；磷酸氫二鈉；瓊脂；焦磷酸鐵；乳酸鈣；毛子草酮 混勻蒸餾水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌滅菌萘啶酮酸；滅菌維生素K 1; 無菌脫纖維綿羊血混勾，滅菌蒸餾水定容到l〇〇〇ml后分裝。
[0012] 實(shí)施例2,配方為：牛肝粉10. 0g ;麥芽浸粉5. 0g ;酵母浸出粉5. 0g ;氯化鈉5. 0g ; 磷酸氫二鈉3. 0g ;瓊脂15. 0g ;焦磷酸鐵0. 3g ;乳酸鈣0. 03g ;萘啶酮酸0. 03g ;毛子草酮 0. 003g;維生素& 0. 01g;絡(luò)蛋白磷酸肽0. lg;無菌脫纖維綿羊血80ml;;蒸餾水加至 1000ml。制備方法稱取牛肝粉；麥芽浸粉；酵母浸出粉；氯化鈉；磷酸氫二鈉；瓊脂；焦磷 酸鐵；乳酸鈣；毛子草酮混勻，蒸餾水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌滅菌 萘啶酮酸；滅菌維生素k 1;滅菌絡(luò)蛋白磷酸肽；無菌脫纖維綿羊血混勻，滅菌蒸餾水定容到 1000ml后分裝。
[0013] 實(shí)施例3,配方為：牛肝粉5. 0g ;麥芽浸粉3. 0g ;酵母浸出粉10. 0g ;氯化鈉5. 0g ; 磷酸氫二鈉3. 0g ;瓊脂20. 0g ;焦磷酸鐵0. 2g ;乳酸鈣0. 03g ;萘啶酮酸0. 01g ;毛子草酮 0. 001g ;維生素& 0. 03g ;絡(luò)蛋白磷酸肽0. 3g ;無菌脫纖維綿羊血90ml ;濃度200g / L的生 地黃水提液250ml;;蒸餾水加至1000ml。制備方法制備方法：（1)取50g生地黃加水煮沸 45min，過濾，取濾液，根據(jù)濾液體積，采取濃縮或者加水調(diào)整體積到濃度為200g/L，得生地 黃水提液250ml ; (2)稱取牛肝粉；麥芽浸粉；酵母浸出粉；氯化鈉；磷酸氫二鈉；瓊脂；焦磷 酸鐵；乳酸鈣；毛子草酮混勻溶于步驟（1)所得的生地黃提取液中混勻，210°C滅菌15min， 冷卻到45°C，加入滅菌滅菌萘啶酮酸；滅菌絡(luò)蛋白磷酸肽；滅菌維生素K1;無菌脫纖維綿羊 血混勻，滅菌蒸餾水定容到l〇〇〇ml后分裝。
[0014] 實(shí)施例4,配方為：牛肝粉8. 0g ;麥芽浸粉3. 0g ;酵母浸出粉8. 0g ;氯化鈉5. 0g ; 磷酸氫二鈉3. Og ;瓊脂20.0 g ;焦磷酸鐵0. lg ;乳酸鈣0.0 lg ;萘啶酮酸0. 05g ;毛子草酮 0. 005g ;維生素Ki 0. 05g ;絡(luò)蛋白磷酸肽0. 3g ;天冬酰胺0.0 lg ;無菌脫纖維綿羊血100ml ; 濃度200g / L的生地黃水提液300ml ;;蒸餾水加至1000ml。制備方法：（1)取60g生地黃 加水煮沸60min，過濾，取濾液，根據(jù)濾液體積，采取濃縮或者加水調(diào)整體積到濃度為200g/ L，得生地黃水提液300ml ; (2)稱取牛肝粉；麥芽浸粉；酵母浸出粉；氯化鈉；磷酸氫二鈉； 瓊脂；焦磷酸鐵；乳酸鈣；毛子草酮；天冬酰胺混勻溶于步驟（1)所得的生地黃提取液中混 勻，210°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌滅菌萘啶酮酸；滅菌絡(luò)蛋白磷酸肽；滅菌維生 素K 1;無菌脫纖維綿羊血混勻，滅菌蒸餾水定容到1000ml后分裝。所述生地黃水提液濃度 200g/L指的是每升含有生藥200g。
[0015] 臨床試驗(yàn)資料如下。
[0016] 1對象與方法。
[0017] 1. 1培養(yǎng)基制備：實(shí)驗(yàn)組共設(shè)4組，分別為實(shí)施例1方案組；實(shí)施例2方案組、實(shí) 施例3方案組、實(shí)施例4方案組和對照組，對照組為普通血瓊脂培養(yǎng)板（BAP)培養(yǎng)基，其配 方為：牛肉粉5g / L、蛋白胨12g / L、瓊脂15g / L、氯化鈉5g / L、無菌脫纖維綿羊血 100ml / L〇
[0018] 1. 2痰液采集培養(yǎng)方法：臨床診斷為足分支菌病患者39例，取膿液用接種環(huán)分區(qū) 劃線接種于實(shí)施例1方案組；實(shí)施例2方案組；實(shí)施例3方案組；實(shí)施例4方案組和對照組 培養(yǎng)基。37°C保溫，保溫箱培養(yǎng)48h、96h挑取細(xì)小菌落進(jìn)行菌屬鑒定。各樣本編號送檢PCR 做分子生物學(xué)鑒定。
[0019] 1. 3細(xì)菌培養(yǎng)陽性檢出標(biāo)準(zhǔn)：取出培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況，依據(jù)《臨 床微生物學(xué)診斷與圖解》挑選奴卡氏菌屬目標(biāo)菌涂片，并行革蘭氏染色和顯微鏡鏡檢，陽性 標(biāo)準(zhǔn)依從《臨床微生物學(xué)診斷與圖解》。最終結(jié)果金標(biāo)準(zhǔn)為PCR鑒定。
[0020] 2結(jié)果：39份樣本中經(jīng)PCR最后鑒定為奴卡菌陽性的為19例，按照標(biāo)號選出上述 19例標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。48h、96h各組檢出陽性菌株例數(shù)見下表，
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種足分支菌病診斷用培養(yǎng)基，其特征在于，每升中含有牛肝粉10.Og;麥芽浸粉2.Og;酵母浸出粉5.Og;氯化鈉5.Og;磷酸氫二鈉3.Og;瓊脂15.Og;焦磷酸鐵0.Ig;乳酸 媽0. 05g;萘啶酮酸0. 05g;毛子草酮0.OOlg;維生素K1 0.Ig;無菌脫纖維綿羊血100mL;; 蒸餾水加至1000ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種足分支菌病診斷用培養(yǎng)基。屬于檢驗(yàn)微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，其特征在于，配方含有牛肝粉、麥芽浸粉、酵母浸出粉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、瓊脂、焦磷酸鐵、乳酸鈣、萘啶酮酸、毛子草酮、維生素K1、無菌脫纖維綿羊血、蒸餾水。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠，分離率高、培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-04
【公開號】CN104846055
【申請?zhí)枴緾N201510298115
【發(fā)明人】李進(jìn)紅, 江菲菲
【申請人】李進(jìn)紅
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年6月4日