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新型癌癥標記物的制作方法

文檔序號:8523962閱讀:581來源:國知局
新型癌癥標記物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是原申請的申請日為2008年02月21日,申請?zhí)枮?00880005551. X,發(fā)明名稱為《新型癌癥標記物》的中國專利申請以及該申請的分案申請一申請?zhí)枮?201210495659. X、發(fā)明名稱為《新型癌癥標記物》的中國專利申請一的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種用于癌癥中基因啟動子的超甲基化(hypermethylation)的新型 標記物。更具體地說,本發(fā)明涉及一種測定在呼吸消化系統(tǒng)(aero-digestive system)內(nèi) 是否發(fā)生腫瘤,或者測定受試者對這種腫瘤進行治療后是否復(fù)發(fā)的方法。本發(fā)明的方法包 括測定一個或多個特定基因的啟動子區(qū)域/序列中CpG位點的甲基化狀態(tài)。本發(fā)明還涉及 對這種甲基化的基因的使用和用來測定癌癥的診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003] 在人類癌癥中,受損的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)與基因突變同樣普遍。這些機理在數(shù)量上 和質(zhì)量上發(fā)生了會導(dǎo)致選擇性生長優(yōu)勢的基因表達變化,而這可能產(chǎn)生癌性轉(zhuǎn)變的結(jié)果。 在與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)的基因啟動子內(nèi)的異常超甲基化的CpG島是癌癥中最常見的表觀遺傳 學(xué)變化(epigenetic change)。由于疾病的早期測定可能提高大多類型癌癥的臨床療效結(jié) 果,因此,對與癌癥有關(guān)的異常的基因甲基化的確定反映了具有前景的新型生物標記物。對 于呼吸消化系統(tǒng)中的癌癥(包括結(jié)腸直腸癌)來說,開始的研宄已經(jīng)確定了異常甲基化的 DNA在患者血液和糞中的存在。由于對高危腺瘤和低危時期癌瘤進行早期測定的潛在臨床 效應(yīng),已經(jīng)存在于良性腫瘤中且僅少見于正常粘膜中高頻率異常超甲基化的基因可能成為 良好的候選診斷生物標記物。
[0004] 然而,通?,F(xiàn)有的用于呼吸消化系統(tǒng)癌癥的早期標記物的靈敏度和特異性依然很 差,并且到目前為止,僅少量的實際被篩選用于甲基化的基因顯示了理想較高的靈敏度和 特異性。根據(jù)馬勒等人(Muller et al.)和陳等人(Chen et al.)的報道,在VIM(波形蛋 白)和SFRP2中發(fā)現(xiàn)了特異性超甲基化,并且最近在來自林德等人(Lind et al)的報道中 提出ADAMTS1和CRABP1在結(jié)腸直腸腫瘤中具有高頻率的癌癥特異性超甲基化,而NR3C1的 超甲基化頻率卻要低得多。林德等人還確定了 18種作為結(jié)腸直腸癌的潛在標記物的基因。 在莫里等人(Mori et al.)的研宄中,鑒于MAL的甲基化頻率低(對應(yīng)于僅6%的甲基化 (2/34樣品)),得出了林德等人所討論的18種候選基因之一的T細胞分化蛋白MAL可能 不是合適的用于呼吸消化道癌癥的診斷生物標記物的結(jié)論。發(fā)明人對18種候選基因中的 多個進行的進一步的分析也沒有產(chǎn)生推動性的結(jié)果:NDRG1在所有被分析樣品中未被甲基 化;NR3C1雖然被甲基化,但是僅發(fā)生為非常低的頻率,而且在隨后的SDHA序列分析中不能 證實該基因一致性,從而使其不適于作為癌癥發(fā)展的標記物。
[0005] 總而言之,不存在有這種啟示:任何由林德等人所討論的基因可以對目前的癌癥 檢測技術(shù)做出改進。因此需要這樣一組基因,其中的各個基因在癌癥中被高頻率且特異性 地超甲基化。更具體地,需要這樣一組基因:該基因在非侵入技術(shù)(例如涉及使用糞便樣品 的技術(shù)),或在可以用在易于獲得的樣品材料(例如血液或粘液)上的技術(shù)中是有用的。這 種基因組可以極大地改進對這些癌癥進行早期檢測的可能。最終的目標可以為開發(fā)對僅少 數(shù)(例如兩種或三種)高頻率的基因標記物中的超甲基化作用進行測定的診斷測試。
[0006] 因此,需要確定其他的基因,在這些基因中,啟動子區(qū)域內(nèi)的CpG島在癌癥中以高 頻率被超甲基化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明建立在發(fā)明人對以下的實現(xiàn):由林德等人確定為潛在標記物的特定基因亞 群具有在呼吸消化癌癥中以非常高的頻率被甲基化的CpG位點。
[0008] 因此,本發(fā)明的一個目的是提供一組用于癌癥(例如呼吸消化系統(tǒng)中的癌癥,特 別是結(jié)腸癌和結(jié)腸直腸癌)的診斷標記物。該組標記物解決了用于癌癥的大多數(shù)已知標記 物中甲基化低特異性和低頻率的問題。
[0009] 因此,本發(fā)明的一方面涉及一種用來測定受試者是否已經(jīng)發(fā)生、正在發(fā)生或易于 發(fā)生癌癥、或者受試者在癌癥治療后是否復(fù)發(fā)的方法,該方法包括以下步驟:
[0010] a)測定從所述受試者獲得的樣品中的至少一個基因內(nèi)的啟動子區(qū)域、第一外顯子 或內(nèi)含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài), 其中,所述基因選自由以下所組成的組中:
[0011] CNRIP1,例如由恩薩姆博(ensembl)(基因組結(jié)構(gòu)注釋數(shù)據(jù)庫)基因編號 ENSG00000119865、恩垂茲(entrez)(美國國家生物技術(shù)信息中心提供的在線資源檢索系 統(tǒng))編號25927所確定;
[0012] SPG20,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定;
[0013] FBN1,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定;
[0014] SNCA,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定;和
[0015] INA,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
[0016] 該方法還可以包括以下步驟:
[0017] b)與參照物比較甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài); 和
[0018] c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)高于參照 物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài),則將所述受試者確定 為可能:發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或在癌癥治療后復(fù)發(fā),如果甲基化水平、甲基化 的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)低于所述參照物的甲基化水平、甲基化的CpG 位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài),則將所述受試者確定為不太可能:發(fā)生了、正在發(fā)生 或易于發(fā)生癌癥、或在癌癥治療后復(fù)發(fā)。
[0019] 本發(fā)明的另一方面涉及一種用來測定受試者是否已經(jīng)發(fā)生、正在發(fā)生或易于發(fā)生 癌癥、或者受試者在癌癥治療后是否復(fù)發(fā)的方法,該方法包括以下步驟:
[0020] a)測定來自受試者的樣品內(nèi)的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點 的甲基化狀態(tài)
[0021] b)構(gòu)建得自健康人群樣品的所述至少一種基因的甲基化水平、甲基化的CpG位點 的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)的百分位數(shù)圖;
[0022] c)基于健康人群中測定的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲 基化狀態(tài)并基于患有癌癥人群中測定的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點 的甲基化狀態(tài),構(gòu)建R0C (受試者操作特性)曲線;
[0023] d)從R0C曲線中選擇所期望的靈敏度和特異性的結(jié)合;
[0024] e)從百分位數(shù)圖測定相應(yīng)于所測定的或選擇的特異性的甲基化水平、甲基化的 CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài);和
[0025] f)如果樣品中的所述至少一種基因的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或 CpG位點的甲基化狀態(tài)等于或高于相應(yīng)于期望的靈敏度/特異性結(jié)合的所述甲基化水平、 甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài),則預(yù)測受試者可能患有癌癥,并且如果 樣品中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)低于相應(yīng)于期望 的靈敏度/特異性結(jié)合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化 狀態(tài),則預(yù)測受試者不太可能患有癌癥。
[0026] 本發(fā)明還涉及用來測定癌癥的診斷試劑盒,該診斷試劑盒含有一個或多個寡核苷 酸引物或一組或多組寡核苷酸引物,它們中的每一個與選自以下的基因的核苷酸序列互 補:
[0027] CNRIP1,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定;
[0028] SPG20,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定;
[0029] FBN1,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定;
[0030] SNCA,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定;和
[0031] INA,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
[0032] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的標記物的應(yīng)用。因此,本發(fā)明進一步涉及:一個或多個選自 由以下所組成的組中的基因在診斷分析中的應(yīng)用:
[0033] CNRIP1,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定;
[0034] SPG20,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定;
[0035] FBN1,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定;
[0036] SNCA,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定;和
[0037] INA,例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118
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