家基因GAPDH的上游引物、所述檢測(cè)管家基因GAPDH 的下游引物和所述檢測(cè)管家基因GAPDH的探針濃度分別為500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、 2. 5pm〇
[0060] 由于在等位基因特異性引物內(nèi)引入了錯(cuò)配的堿基，使其在反應(yīng)時(shí)的效率下降，不 同的引物下降程度不同，通常要增加10至20個(gè)循環(huán)才能達(dá)到?jīng)]有錯(cuò)配時(shí)的效果，保證檢 測(cè)的靈敏度，優(yōu)選PCR反應(yīng)按兩步擴(kuò)增循環(huán)程序進(jìn)行，且第一步擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)小于第二步 擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，所述第一步擴(kuò)增的退火溫度高于第二步擴(kuò)增的退火溫度，第一步擴(kuò)增使用 較高退火溫度，第二步擴(kuò)增使用較低退火溫度，目的是增加第一步擴(kuò)增時(shí)引物退火時(shí)的特 異性，從而保證Past-PCR檢測(cè)高度特異性的目的；具體而言優(yōu)選所述PCR反應(yīng)的條件為： 37°C 2min，95°C 2min 預(yù)變性；第一步擴(kuò)增，95°C 變性 5s，55°C~68°C 退火 32s，循環(huán) 10~15次；第二步，95°C變性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循環(huán)30~50次，收集熒光信 號(hào)；更為優(yōu)選PCR反應(yīng)的條件為：37°C 2min，95°C 2min預(yù)變性；第一步擴(kuò)增，95°C變性 5s，63°C退火32s，循環(huán)15次；第二步，95°C變性5s，60°C退火32s，循環(huán)40次，收集熒 光信號(hào)。
[0061] 具體的檢測(cè)過程為： 1) 將待檢測(cè)樣品分別放入預(yù)先分別包被有野生型特異引物、共用的下游引物、探針、檢 測(cè)管家基因GAPDH的上游引物、檢測(cè)管家基因GAPDH的下游引物和檢測(cè)管家基因GAPDH的 探針以及突變型特異引物、共用的下游引物、探針、檢測(cè)管家基因GAPDH的上游引物、檢測(cè) 管家基因GAPDH的下游引物和檢測(cè)管家基因GAPDH的探針兩組PCR反應(yīng)管內(nèi)，并加入PCR 緩沖液、dNTPs和Taq酶混合液、滅菌超純水和基因組DNA，蓋緊管蓋，在熒光定量PCR儀上 進(jìn)行反應(yīng)，并收集熒光信號(hào)； 2) 如果檢測(cè)樣本僅有突變型反應(yīng)管在FAM通道有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線，同時(shí)VIC通道 有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線，可判定樣本為A型，即突變型純合子； 如果檢測(cè)樣本僅有野生型反應(yīng)管在FAM通道有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線，同時(shí)VIC通道有 對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線，可判定樣本為T型，即野生型純合子； 如果檢測(cè)樣本突變型和野生型反應(yīng)管在FAM通道均無對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線，可能樣本 或操作存在問題，或者樣本DNA濃度過低，應(yīng)重新提取樣本DNA進(jìn)行試驗(yàn)。
[0062] 下面詳述檢測(cè)過程中各組份介紹： (一）等位基因特異性引物： 等位基因特異性引物的等位基因特異性核苷酸部分互補(bǔ)于基因的一個(gè)等位基因位點(diǎn)， 但不互補(bǔ)于該基因的另一個(gè)等位基因位點(diǎn)。通常而言，等位基因特異性引物的等位基因特 異性核苷酸部分位于等位基因特異性引物的3'端的末位堿基。在某些情況下，等位基因特 異性核苷酸部分也可位于等位基因特異性引物3'末端的其他堿基位置。
[0063] 在一些情況下，等位基因特異性引物除3'末端互補(bǔ)于等位基因位點(diǎn)有所變化外， 我們常常要在引物的其他位置引入錯(cuò)配的堿基，如在引物3'端倒數(shù)第二位或第三位引入堿 基錯(cuò)配，或第二和第三位的連續(xù)錯(cuò)配；針對(duì)不同的多態(tài)性或突變位點(diǎn)，在引物3'端倒數(shù)第 二位或第三位引入堿基錯(cuò)配的基礎(chǔ)上，還可在引物的其它位點(diǎn)增加堿基錯(cuò)配來滿足反應(yīng)特 異性的要求，越遠(yuǎn)離3'端，增加錯(cuò)配的堿基數(shù)越多，在5'端可達(dá)最多。等位基因特異性引 物的長(zhǎng)度主要依據(jù)其^值來決定，通常而言其T m值比PCR循環(huán)的退火溫度低大約5-20°C。
[0064] 兩條檢測(cè)對(duì)應(yīng)基因多態(tài)性的等位基因特異性上游引物，除3'端檢測(cè)的位點(diǎn)其堿基 不同外，其余序列盡可能相同，兩條引物的Tm值也盡可能一致。
[0065] 低1"的等位基因特異性引物（ASP)有更高的特異性。一般情況下，等位基因特異 性引物為短寡核苷酸，其長(zhǎng)度是大約15-30,其Tm是大約40 °C至60 °C，比擴(kuò)增過程中使用的 PCR循環(huán)條件的退火/延伸溫度低大約5°C至20°C。
[0066]由于等位基因特異性引物的設(shè)計(jì)和篩選十分重要，好的引物需要從眾多待選的 引物中選出，因此我們建立了一個(gè)篩選的方法，其等位基因特異性引物的具體篩選過程如 下： ⑴設(shè)計(jì)外圍引物及PCR擴(kuò)增：首先在待檢基因突變點(diǎn)或多態(tài)性位點(diǎn)的上下游，設(shè)計(jì)一 對(duì)PCR擴(kuò)增引物，然后用該對(duì)引物，對(duì)目的基因進(jìn)行常規(guī)的PCR反應(yīng)，其中擴(kuò)增片段長(zhǎng)度可 在幾十至數(shù)千堿基對(duì)，優(yōu)選長(zhǎng)度為200至500堿基對(duì)； ⑵克隆PCR產(chǎn)物：將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，利用AT克隆的方法，重組到普通的T載體質(zhì)粒 中，得到重組質(zhì)粒，其中得到的重組質(zhì)?？梢赃M(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，從而確保PCR產(chǎn)物的正確性； ⑶構(gòu)建重組突變體：根據(jù)生物信息學(xué)所提供的信息，采用分子克隆技術(shù)，將突變體的序 列，構(gòu)建至上述得到的重組質(zhì)粒中，將構(gòu)建的重組突變體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證序列，從而確保其正 確性； ⑷設(shè)計(jì)及篩選突變位點(diǎn)特異性引物：設(shè)計(jì)兩條等位基因特異引物，一條引物的3'端同 突變序列互補(bǔ)，另一條引物的3'端同正常序列互補(bǔ)；然后分別用等位基因特異引物和對(duì)應(yīng) 的常規(guī)PCR共同下游引物配對(duì)，以上述構(gòu)建好的重組突變體作為反應(yīng)模板，利用熒光定量 PCR儀，對(duì)反應(yīng)體系，進(jìn)行篩選；其中，反應(yīng)可采用熒光染料，如SYBR GREEN，也可采用特異 性的Taqman熒光探針，按照所加樣品量為0. 1微克全基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，其具體 的篩選內(nèi)容如下： (a)設(shè)定PCR反應(yīng)條件：首先設(shè)定PCR反應(yīng)的退火溫度完全一致，具體溫度為55°C~ 68°C，PCR循環(huán)次數(shù)為40次，PCR反應(yīng)的酶和緩沖體系均優(yōu)化后固定不變，此反應(yīng)條件的設(shè) 定是為了方便同時(shí)檢測(cè)多種基因突變； (b)特異性篩選：采用突變型的引物以野生型的重組質(zhì)粒為模板，篩選出的引物其Ct 大于40 ; 其中循環(huán)閾值的確定原因如下，突變型引物在野生型模板發(fā)生非特異性擴(kuò)增比野生型 引物在野生型模板發(fā)生特異性擴(kuò)增多19個(gè)循環(huán)，按照臨床實(shí)際檢測(cè)時(shí)，所加樣品量為0. 1 微克全基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)，我們通過下列公式，拷貝數(shù)=(DNA量ngX6. 022X 1023V(長(zhǎng)度 bpX 109X660)，其中全基因組DNA的長(zhǎng)度為30億對(duì)堿基，因此0. 1微克全基因組DNA的拷 貝數(shù)為：3. 09X 104,反映在熒光定量PCR的Ct(定量循環(huán)閾值)大概為21，這樣我們得到第 二個(gè)篩選指標(biāo)，即用突變型的引物，在野生型的重組質(zhì)粒為模板時(shí)，所得的Ct應(yīng)該大于40， 方能保證檢測(cè)不會(huì)出現(xiàn)假陽性，兩者的擴(kuò)增效率相差為40-21=19個(gè)循環(huán)，即擴(kuò)增效率相差 19個(gè)循環(huán)以上，將成為我們判斷等位基因特異性引物特異性好壞的客觀指標(biāo)。我們知道當(dāng) 引物3'端與模板錯(cuò)配時(shí)，延伸效率將下降103-1066倍，換算成反應(yīng)循環(huán)數(shù)則下降約13至 27個(gè)循環(huán)，這就是我們能篩選出理想引物的理論依據(jù)，因?yàn)椴贿M(jìn)行引物篩選，19-13=6個(gè)循 環(huán)，勢(shì)必產(chǎn)生假陽性，該引物的特異性就不好，而19-27=-8,不可能產(chǎn)生假陽性，有8個(gè)循環(huán) 數(shù)的范圍供我們對(duì)引物進(jìn)行篩選。按照這一要求，我們?cè)O(shè)計(jì)一系列等位基因特異性引物，從 長(zhǎng)短上、從靠近3'端人為引入堿基錯(cuò)配上著手，加上其配對(duì)的下游引物，利用構(gòu)建好的野生 型和突變型重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)的交叉篩選，即當(dāng)用突變引物與野生型 的模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，與用野生型引物同野生型模板的反應(yīng)要多用19個(gè)循環(huán)數(shù)以上，反之亦 然，那么這樣的引物就具備高度的特異性。
[0067] (c)敏感性篩選：將篩選出的特異性引物用與重組突變型質(zhì)粒作敏感性試驗(yàn)，將檢 測(cè)靈敏度小于10-1000個(gè)拷貝的特異性引物篩選出來，即為所需的突變特異性引物。
[0068] 通過以上幾方面的篩選，所得到的等位基因特異性引物將具備高度特異和高度敏 感的理想引物。
[0069](二）檢測(cè)探針： 在一些情況下，檢測(cè)探針的^值大約為60°C至70°C，最佳為63°C，探針長(zhǎng)度根據(jù)其 TJ1決定。盡管有多種不同形式的探針可供選擇，Taqman探針（Applied Biosystems， FosterCity)常常是首選。在一些特殊的情況下，如檢測(cè)序列中AT含量過高，可以采用提高 TJ直的Taqman-MGB等類型的探針。
[0070] 共用的特異性引物，在一些情況下，共用的特異性引物的1"值大約為50°C至 70 °C，最佳為60 °C，其長(zhǎng)度由其Tm值決定，一般在15-25堿基之間。
[0071] (三）其他成分： 本發(fā)明使用的DNA聚合酶是Taq酶，及其突變體、衍生物或片段，也可是其他的耐熱DNA聚合酶，在一些情況下，也可采用Hotstart Taq酶，以增加反應(yīng)的特異和高效性。
[0072] 本發(fā)明中所提供的針對(duì)BRAF基因V600E突變位點(diǎn)的引物、試劑盒及其PCR方法， 主要是針對(duì)等位基因特異性引物PCR擴(kuò)增法的缺點(diǎn)，利用分子克隆技術(shù)，事先分別構(gòu)建含 待檢基因野生型和突變型的重組質(zhì)粒，以此重組質(zhì)粒為陽性模板，篩選確定特異地分別與 3'末端突變位點(diǎn)或野生位點(diǎn)堿基互補(bǔ)的兩條特異引物，一旦篩選出的特異引物序列，將是 我們檢測(cè)體系的關(guān)鍵元素。本發(fā)明的上述產(chǎn)品，可用于任何型號(hào)的熒光定量PCR儀，試劑成 本同如今市面上的熒光定量PCR試劑相當(dāng)，因此較好地克服了其他采用等位基因特異性引 物PCR擴(kuò)增法的不足。
[0073] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：所述的引物和試劑盒具有操作簡(jiǎn)單，成本低，結(jié)果判斷簡(jiǎn)單容 易，靈敏度高，本試劑盒檢測(cè)基因突變靈敏度可以達(dá)到1% (即目的基因的突變基因DNA模 板數(shù)占野生型DNA模板數(shù)的