重組人半乳糖腦苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的純化的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組人半乳糖腦苷脂-半乳糖苷酶的純化方法和通過(guò)此方法得到 的產(chǎn)物。
【背景技術(shù)】
[0002] 半乳糖腦苷脂-半乳糖苷酶是一種能催化半乳糖腦苷脂的半乳糖水解的酶。 它的缺乏可以導(dǎo)致組織中半乳糖腦苷脂的蓄積。已經(jīng)有研宄表明，可以從天然標(biāo)本中，如 肝（Ben-Yoseph,ArchivesofBiochemistryandBiophysics, 1979)、淋巴細(xì)胞（Sakaiet al,J.Biochem.，1994)和尿（Sakaietal,J.Biochem.，1994)，進(jìn)行人GALC的部分純化。由 于GALC的極端的疏水性和低豐度，所以已知的這些純化方法很復(fù)雜?；厥章史浅５?，只能 獲得全長(zhǎng)GALC(80kDa)和加工片段（主要50和30kDa)的混合物。此外，先前的研宄只是 針對(duì)酶的特性而不是為了人體酶替代療法（ERT)而進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
[0003] 因此，產(chǎn)生在適用于人體的生理溶液中具有高純度的均勻產(chǎn)品（80kDarhGALC)的 改進(jìn)的rhGALC純化方法是有利的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 開(kāi)發(fā)了一種純化重組人半乳糖腦苷脂-0-半乳糖苷酶（rhGALC)的方法，其產(chǎn)生 滿(mǎn)足動(dòng)物/人類(lèi)研宄對(duì)質(zhì)量和純度的要求的終產(chǎn)物。所述方法包括三個(gè)主要的色譜步驟和 一個(gè)可選的UFDF制劑步驟。在此研宄中，從20升補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器中得到的新鮮和澄 清的收獲物用最優(yōu)化的方法純化來(lái)產(chǎn)生用于動(dòng)物/人類(lèi)研宄的rhGALC。
[0005] 所述純化方法基于包括不同作用模式的捕獲、中度純化（intermediate)和精制 色譜步驟的三步法。優(yōu)選地，所有步驟都以結(jié)合模式進(jìn)行，并在洗脫前包括洗滌步驟。在一 個(gè)具體實(shí)施方案中：捕獲步驟是用Capto?Blue,，中度純化步驟是用Capto?Adhere，精制 步驟是用ToyopearlEther。所述方法的實(shí)施方案包括兩個(gè)專(zhuān)用的病毒失活/去除步驟。 可由UFDF制備產(chǎn)物池，然后無(wú)菌過(guò)濾成最終產(chǎn)物。
[0006] 最終目的是生產(chǎn)rhGALC作為酶替代療法用于治療溶酶體酶貯積病球形細(xì)胞腦白 質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（Krabbe氏病）。Krabbe病是由酶GALC遺傳缺陷引起的。GALC缺乏導(dǎo)致鞘脂 類(lèi)代謝產(chǎn)物半乳糖基鞘氨醇（鞘氨醇半乳糖苷）的逐漸累積、脫髓鞘和過(guò)早死亡。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種純化rhGALC的方法。特別地，本發(fā)明的目的是提 供一種純化rhGALC的方法，其在動(dòng)物和人類(lèi)中可用地解決上述問(wèn)題。
[0008] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化重組人半乳糖腦苷 脂-0 -半乳糖苷酶（rhGALC)的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)物的包含rhGALC的級(jí)分在樹(shù)脂 上進(jìn)行色譜法，所述方法包括：
[0009] a)捕獲步驟：其中將所述rhGALC在第一多峰色譜樹(shù)脂上純化，任選地隨后通過(guò)離 子分尚進(jìn)行病毒滅活和/或純化；
[0010] b)中度純化步驟：其中所述rhGALC在第二多峰色譜樹(shù)脂上純化，任選地隨后通過(guò) 離子分離進(jìn)行病毒滅活和/或純化；
[0011] C)精制步驟：其中所述rhGALC在色譜樹(shù)脂上純化，所述樹(shù)脂選自多峰色譜樹(shù)脂、 陰離子交換樹(shù)脂和疏水相互作用色譜（HIC)樹(shù)脂。
[0012] 在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化重組人半乳糖 腦苷脂（rhGALC)的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)物的包含rhGALC的級(jí)分在樹(shù)脂上進(jìn)行色譜 法，所述方法包括：
[0013] a)提供所述細(xì)胞培養(yǎng)物的包含rhGALC的級(jí)分；
[0014] b)將所述細(xì)胞培養(yǎng)物的級(jí)分裝載到包含靜電配體的第一多峰色譜樹(shù)脂上；
[0015] c)將rhGALC從第一多峰色譜樹(shù)脂上洗脫到包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇 (V/V)的第一洗脫緩沖液中；d)將所述第一洗脫液裝載到含陰離子和疏水配體的第二多峰 色譜樹(shù)脂上；
[0016] e)將rhGALC從第二多峰色譜樹(shù)脂上洗脫到pH低于5. 5、包含至少30%的丙二醇 和/或乙二醇（體積/體積）第二洗脫緩沖液中；
[0017]f)將所述第二洗脫液裝載到有疏水性配體的第三多峰色譜樹(shù)脂上；和
[0018] g)將rhGALC從所述第三多峰色譜樹(shù)脂上洗脫到水性緩沖液中，藉此得到第三洗 脫液。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含rhGALC的組合物。該組合合物可通過(guò)本發(fā)明的純 化方法得到。
[0020] 本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供用作藥物的本發(fā)明組合物。
[0021] 本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供用于治療球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（Krabbe氏?。┑?本發(fā)明組合物。
[0022] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（克拉伯?。?和/或減少或減輕與球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（克拉伯病）相關(guān)的癥狀的方法，所述方法 包括將包含本發(fā)明的純化rhGALC的組合物給予有需要的受試者的步驟。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖 1
[0024] 圖1示出所述純化rhGALC的方法的概要。將20升生物反應(yīng)器的收獲物通過(guò)三 個(gè)試驗(yàn)規(guī)模的色譜周期進(jìn)行純化。將Ether產(chǎn)物匯集，所述方法繼續(xù)一個(gè)周期得到終產(chǎn)物 TG1106〇
[0025]圖 2
[0026] 圖2示出了三個(gè)色譜周期以及UFDF和過(guò)濾周期中每個(gè)步驟的產(chǎn)率（％活性）。右 邊顯示從澄清收獲物到終產(chǎn)物的總收率?；钚酝ㄟ^(guò)至少兩次稀釋一式兩份進(jìn)行測(cè)定，除了 Ether步驟的產(chǎn)物在一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)定。
[0027]圖 3
[0028] 圖3示出從澄清的收獲物到終產(chǎn)物的總剩余活性的的概況。活性測(cè)量同圖2。
[0029]圖 4
[0030] 圖4顯示終產(chǎn)物TG1106和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)StG02、StG03的Westernblot分析。GALC用 針對(duì)StG02產(chǎn)生的的兔多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0031] 圖 5
[0032] 圖5示出Ether產(chǎn)物、UFDF產(chǎn)物和終產(chǎn)物TGI106以及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)StGO的Western blot分析3。GALC用針對(duì)StG02產(chǎn)生的兔多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0033] 圖 6
[0034] 圖6示出TG11063-10和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)StG03在pH3-10凝膠上的等電點(diǎn)聚焦。
[0035]圖 7
[0036] 圖7示出終產(chǎn)物TG1106和下游處理樣品的膠體藍(lán)染色的SDS-PAGE。
[0037]圖 8 和 9
[0038] 圖8和9示出各種濃度的終產(chǎn)物TG1106和StG03的膠體藍(lán)染色的SDS-PAGE。
[0039] 圖 10
[0040] 圖10示出終產(chǎn)物TG1106和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)StG03的膠體藍(lán)染色的NativePAGE(4_16% Bis-Tris，G250 電荷轉(zhuǎn)移，PH7. 0)。
[0041] 下面更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 方法
[0043] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及到一種用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化重組人半乳糖腦苷 脂-0 -半乳糖苷酶（rhGALC)的方法，其中將所述細(xì)胞培養(yǎng)物的包含rhGALC的級(jí)分在樹(shù)脂 上進(jìn)行色譜法，所述方法包括：
[0044] a)捕獲步驟：其中所述rhGALC在第一多峰色譜樹(shù)脂上純化，任選地隨后通過(guò)離子 分離進(jìn)行病毒滅活和/或純化
[0045] b)中度純化步驟：其中所述rhGALC在第二多峰色譜樹(shù)脂上純化，任選地隨后通過(guò) 離子分離進(jìn)行病毒滅活和/或純化。
[0046] c)精制步驟：其中所述rhGALC在色譜樹(shù)脂上純化，所述樹(shù)脂選自多峰色譜樹(shù)脂、 陰離子交換樹(shù)脂和疏水相互作用色譜（HIC)樹(shù)脂。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述中度純化步驟包括在所述第二多峰色譜樹(shù)脂 上純化所述rhGALC，隨后在選自以下的色譜樹(shù)脂上純化所述rhGALC:
[0048]i)不同于所述第一和第二多峰色譜樹(shù)脂的多峰色譜樹(shù)脂；和
[0049] ii)疏水相互作用色譜（HIC)樹(shù)脂。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，所述第一和第二多峰色譜樹(shù)脂是不同的樹(shù)脂。
[0051 ] 特別地，所述第一多峰色譜樹(shù)脂可以包括靜電配體。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，所述第二多峰色譜樹(shù)脂包括陰離子和疏水配體。
[0053] 在另一些實(shí)施方案中，所述精制步驟中的色譜樹(shù)脂是具有疏水性配體的樹(shù)脂。
[0054] 所述第一多峰色譜樹(shù)脂可特別包含式如下所述的（VI)的配體化合物。
[0055] 所述第二多峰色譜樹(shù)脂可特別包含如下所述的式（VIII)的配體化合物。
[0056] 根據(jù)其他實(shí)施方案，所述第一多峰色譜樹(shù)脂特別包含如下所述的式（VI)化合物 作為配體。并且所述第二多峰色譜樹(shù)脂特別包含如下所述的式（VIII)化合物作為配體。根 據(jù)這些實(shí)施方案，優(yōu)選的是所述rhGALC隨后在樹(shù)脂上純化，所述樹(shù)脂為醚樹(shù)脂。合適的醚 樹(shù)脂的實(shí)例在下面給出。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將所述rhGALC從所述第一多峰色譜樹(shù)脂上洗脫 到包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇（V/V)的第一洗脫緩沖液中；
[0058] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，將所述rhGALC從所述第二多峰色譜樹(shù)脂上洗脫到 pH低于5. 5、包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇（v/v)的第二洗脫緩沖液中。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明，所述純化重組人半乳糖腦苷脂（rhGALC)的方法可特別地包括：
[0060] a)提供所述細(xì)胞培養(yǎng)物的包含rhGALC的級(jí)分；
[0061]b)將所述細(xì)胞培養(yǎng)物的級(jí)分裝載到包含精典配體的第一多峰色譜樹(shù)脂上；
[0062] c)將rhGALC從所述第一多峰樹(shù)脂上洗脫到包含至少30%的丙二醇和/或乙二醇 (V/V)的第一洗脫緩沖液中，藉此得到第一洗脫液；
[0063] d)將所述第一洗脫液裝載到所述包含陰離子和疏水配體的第二多峰色譜樹(shù)脂 上；
[0064] e)將rhGALC從所述第二多峰樹(shù)脂上洗脫到pH低于5. 5、包含至少30%的丙二醇 和/或乙二醇（體積/體積）的第二洗脫緩沖液中，藉此得到第二洗脫液；
[0065]f)將所述第二洗脫液裝載到具有疏水性配體的第二多峰色譜樹(shù)脂上；和
[0066]g)將rhGALC從所述第三多峰色譜樹(shù)脂上洗脫到水性緩沖液中，藉此得到第三洗 脫液。
[0067] 人半乳糖腦苷脂-0-半乳糖苷酶（rhGALC)有幾個(gè)同義詞存在。最常用的是半乳 糖腦苷脂酶，半乳糖（基）神經(jīng)酰胺酶，人半乳糖腦苷脂酶，半乳糖神經(jīng)酰胺半乳糖苷 酶（EC3. 2. 1. 46)。蛋白質(zhì)登錄號(hào)是NP_000144. 2和P45803。應(yīng)理解本發(fā)明的rhGALC可包 含標(biāo)簽。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，術(shù)語(yǔ)人半乳糖腦苷脂_半乳糖苷酶還包括功能相同 的區(qū)域或全長(zhǎng)氨基酸序列的類(lèi)似物。
[0069] 了解rhGALC的某些特性，對(duì)建立純化rhGALC或功能相同的區(qū)域或全長(zhǎng)氨基酸序 列的類(lèi)似物的