具有改進活性的dna聚合酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[OOOU 本發(fā)明提供了具有改進活性（包括增加的逆轉(zhuǎn)錄酶效率）的DM聚合酶，W及該 種聚合酶在各種應(yīng)用中的用途，所述應(yīng)用包括核酸多核巧酸延伸和擴增。
【背景技術(shù)】
[000引 DNA聚合酶負責基因組的復(fù)制和維護，該是在世代間精確傳遞遺傳信息的中屯、職 責。DNA聚合酶作為負責DNA合成的酶而在細胞中起作用。它們在有金屬活化劑如Mg"存 在下，W被復(fù)制的DNA模板或多核巧酸模板支配的順序聚合脫氧核糖核巧S磯酸。在體內(nèi)， DNA聚合酶參與一系列DNA合成過程，包括DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、重組和基因擴增。在每個 DNA合成過程期間，將DNA模板復(fù)制一次或最多幾次W產(chǎn)生相同的復(fù)制品。相反，在體外， DNA復(fù)制可W重復(fù)多次，例如在聚合酶鏈式反應(yīng)期間（參屬，湯絕7,美國專利號4, 683, 202)。 [000引在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)的最初研究中，在每一輪DNA復(fù)制的開始時添加DNA聚 合酶（參屬美國專利號4,683,202，出處同上）。后來，確認了從在高溫下生長的細菌中可 獲得熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，且該些酶只需要添加一次（參屬美國專利號4, 889, 818和美國 專利號4, 965, 188)。在PCR期間使用的高溫下，該些酶沒有不可逆地失活。因此，可W進行 聚合酶鏈式反應(yīng)的重復(fù)循環(huán)，而不需要在每一合成加成過程開始時添加新鮮的酶。DNA聚合 酶特別是熱穩(wěn)定聚合酶，是重組DNA研究中和疾病的醫(yī)學(xué)診斷中的大量技術(shù)的關(guān)鍵。特別 是對于診斷應(yīng)用，祀核酸序列可能僅僅是目標DNA或RNA的一小部分，因此在不擴增的情況 下可能難W檢測到祀核酸序列的存在。
[0004] DNA聚合酶的總體折疊模式類似人的右手，并包含手掌、手指和拇指S個不同的 亞結(jié)構(gòu)域。（參Beese掌260:352-355, 1993);Patel掌，化ocAefflistry34:5351-5363，1995)。盡管在大小和細胞功能方面不同的聚合酶之間手指和拇指亞結(jié) 構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化很大，但是催化性的手掌亞結(jié)構(gòu)域全部都是重疊的（superimpos油le)。 例如，在化學(xué)催化作用期間與引入的dNTP相互作用并穩(wěn)定過渡態(tài)的基序A在哺乳動物 pola和原核生物的polI家族DNA聚合酶之間是重疊的，平均偏差為約lA(Wang掌，保W 89:1087-1099，1997)?；駻在結(jié)構(gòu)上開始于主要包含疏水殘基的反向平行0-鏈，并 延續(xù)到a-螺旋。DNA聚合酶活性部位的主要氨基酸序列是特別保守的。在基序A的情 況下，例如，序列DYSQIELR(SEQIDN0:22)保留在來自通過數(shù)百萬年進化分離的生物的 聚合酶中，所述生物包括例如水生棲熱菌（巧er皿S 別ic化?)、砂眼衣原體學(xué)化？ trachomatis)觀欠顆巧舊{Escherichia coll)。
[0005] 除了高度保守W外，DM聚合酶的活性部位也被證明是相對易變的，能夠容納某些 氨基酸置換而不顯著降低DNA聚合酶活性（參屬，湯絕7,美國專利號6, 602, 695)。該種突變 體DNA聚合酶可W提供多種選擇優(yōu)勢，例如在包括核酸合成反應(yīng)的診斷和研究應(yīng)用中。
[0006] 在DNA聚合的酶促過程中存在至少兩個步驟；1)進入的核巧酸的滲入和2)新滲 入的核巧酸的延伸。DNA聚合酶的整體忠誠度或"保真度"通常被看作該兩種酶活性的聯(lián) 合（conglomerate),但是步驟是不同的。DNA聚合酶可能錯誤滲入進入的核巧酸，但是如果 其不能被有效地延伸，延伸速率將嚴重降低，且整體產(chǎn)物形成將是極小的。可替換地，也可 能具有錯誤滲入進入的核巧酸且容易錯誤延伸新形成的錯配的dm聚合酶。在該種情況 下，整體延伸速率將是高的，但是整體保真度將是低的。當使用Mn"作為二價金屬離子活 化劑時，該種類型的酶的一個例子是ES112DNA聚合酶巧683RZ05DNA聚合酶；參見US 7, 179, 590)。該酶具有非常高的效率，因為不像當遇到錯配時傾向于猶豫/停止的典型DNA 聚合酶，ES112DNA聚合酶容易延伸錯配。ES112中顯示的表型在RT步驟過程中更加明顯， 大概是因為RNA/DNA異源雙鏈體相比于DNA/DNA同源雙鏈體的結(jié)構(gòu)影響。第二個例子是， 如果DNA聚合酶不容易錯誤滲入（可能甚至不太可能錯誤滲入），但是確實具有增加的錯 誤延伸錯配的能力。在該種情況下，對于整體產(chǎn)物而言，保真度沒有顯著改變。一般而言， 在Mn"中，該種類型的酶比ES112的特征更有利于延伸反應(yīng)，因為該產(chǎn)物的保真度得到了提 高。但是，可W利用該種屬性W允許錯誤延伸錯配的寡核巧酸引物，諸如當單一序列的寡核 巧酸引物與具有序列異質(zhì)性的祀標（例如，病毒祀標）雜交時，但是正?；蜉^低的錯誤滲入 速率允許超越初始寡核巧酸引物完成DNA合成。該種類型的DNA聚合酶的一個例子是Z05 D580GDNA聚合酶（參見美國專利公開號2009/0148891)。該種類型的活性被稱為"錯配耐 受的"，因為它對寡核巧酸引物中的錯配更耐受。盡管上面的例子已經(jīng)討論了引物延伸型反 應(yīng)，但是在其中引物延伸頻繁再次發(fā)生的反應(yīng)(諸如RT-PCR和PCR)中，該活性可W更加顯 著。數(shù)據(jù)表明，盡管酶諸如Z05D580G對錯配更加"耐受"，但是它們還具有增強的延伸含有 經(jīng)修飾的堿基（例如，叔了基芐基修飾的堿基）或存在DNA結(jié)合染料諸如SYBRGreenI的 寡核巧酸引物的能力（參見美國專利公開號2009/028053)。
[0007] 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR)是在許多應(yīng)用中用于通過擴增來檢測和/或定 量RNA祀標的技術(shù)。為了通過PCR擴增RNA祀標，必須首先將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通 常，RT-PCR測定依賴于源自嗜中溫生物的非熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶（RNA依賴性DNA聚合酶）來 完成初始cDNA合成步驟（RT)。需要額外的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶來擴增cDNAW耐受在PCR 中核酸變性所需的高溫。使用工程改造的熱活性的或熱穩(wěn)定的DNA聚合酶W進行更有效的 逆轉(zhuǎn)錄進行RT-PCR測定具有幾個潛在的益處。增強的逆轉(zhuǎn)錄酶活性連同使用較高逆轉(zhuǎn)錄 溫育溫度（其允許RNA模板二級結(jié)構(gòu)的松弛）的能力可W導(dǎo)致整體較高的cDNA合成效率 和測定靈敏度。較高溫度溫育也可W通過降低逆轉(zhuǎn)錄步驟中的錯誤引發(fā)而增加特異性。具 有提高的逆轉(zhuǎn)錄效率的酶可W通過使RT溫育時間和/或酶濃度降低而簡化測定設(shè)計。當 使用加TP和UNG時，含有在非嚴謹設(shè)置條件過程中形成的加MP的非特異性延伸產(chǎn)物被UNG 降解，且不能被用作引物或模板。當使用源自嗜中溫生物的非熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶（RNA依賴 性的DNA聚合酶）時，不可能利用加TP和UNG方法。（Myers,T.W.等，Amplification ofRNA:HighTemperatureReverseTranscriptionandDNAAmplificationwith ThermusthermophilusDNAPolymerase,茄PCRStrategies，Innis,M.A. ,Gelfand, D.比，和Sninsky,J.J.,編，AcademicPress,SanDiego,CA, 58-68, (1995))。但 是，本發(fā)明的熱活性的或熱穩(wěn)定的DNA聚合酶用于逆轉(zhuǎn)錄步驟的用途，使所述反應(yīng)與利用 加TP/尿喀晚N-糖基化酶（UNG)遺留物預(yù)防系統(tǒng)完全相容（Longo等，Useof化acilDNA GlycosylasetoControlCarry-overContaminationinPolymeraseChain民eactions. Gene93:125-128，（1990)。除提供遺留物污染控制W外，加TP和UNG的使用提供了 "熱啟 動"W減少非特異性擴增（Innis和Gelfand1999)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本文提供了相對于對應(yīng)的未修飾的對照聚合酶具有改進的活性（包括增加的逆 轉(zhuǎn)錄酶效率）的DNA聚合酶化及制備和使用該樣的DNA聚合酶的方法。在某些實施方案中， 與對照DNA聚合酶相比，改進的DNA聚合酶具有增加的逆轉(zhuǎn)錄酶效率。在某些實施方案中， 與對照DNA聚合酶相比，改進的DNA聚合酶具有相同或基本上相似的DNA依賴性的聚合酶 活性。
[0009] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及與對照DNA聚合酶相比具有增加的逆轉(zhuǎn)錄酶效率的DNA 聚合酶，其中所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是除了M或IW 外的任意氨基酸，且其中除了所述對照DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨 基酸是M或IW外，所述對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。在某 些實施方案中，所述改進的DNA聚合酶包含與SEQIDN0:1具有實質(zhì)同一性（例如，至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性）的氨基酸序列，其中所述DNA聚合酶的與 SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是除了M或IW外的任意氨基酸。在某些實施方案 中，除了所述對照DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是M或IW外，所 述對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在某些實施方案中，所 述改進的聚合酶的與SEQIDN0:1的位置763對應(yīng)的位置處的氨基酸選自G、A、V、R、F、W、 P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、L或H。在某些實施方案中，所述改進的聚合酶的與SEQIDN0:1 的位置763對應(yīng)的位置處的氨基酸是T。
[0010] 在某些實施方案中，所述DNA聚合酶包含與SEQIDNO: 1具有至少90%同一性的 氨基酸序列。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨 基酸是T。在某些實施方案中，與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是除了DW外的任 意氨基酸。在某些實施方案中，與SEQIDN0:1的位置580對應(yīng)的氨基酸選自L、G、T、Q、A、 S、N、R和K。在某些實施方案中，與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是除了IW外 的任意氨基酸。在某些實施方案中，與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸選自K、R、S、 G和A。在某些實施方案中，與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是除了DW外的任意 氨基酸，且與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是除了 外的任意氨基酸。在某些 實施方案中，與SEQIDN0:1的位置580對應(yīng)的氨基酸選自L、G、T、Q、A、S、N、R和K，且與SEQIDN0:1的位置709對應(yīng)的氨基酸選自K、R、S、G和A。在某些實施方案中，與SEQID NO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是G，且與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是K。在特 定實施方案中，與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是T，與SEQIDNO: 1的位置709 對應(yīng)的氨基酸是K，且與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是G。在某些實施方案中， 所述DNA聚合酶具有與所述對照DNA聚合酶相比相同或基本上相似的DNA依賴性的聚合酶 活性。在某些實施方案中，與對照DNA聚合酶相比，所述DNA聚合酶具有增加的逆轉(zhuǎn)錄酶效 率，而沒有DNA依賴性的聚合酶活性的顯著下降，其中所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的 位置763對應(yīng)的氨基酸是除了M或IW外的任意氨基酸，且與SEQIDNO: 1的位置709對 應(yīng)的氨基酸是除了IW外的任意氨基酸，且其中除了所述對照DM聚合酶的與SEQIDN0:1 的位置763對應(yīng)的氨基酸是M或IW外，所述對照DM聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同 的氨基酸序列，且與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是I。
[0011] 在某些實施方案中，所述改進的DM聚合酶包含與SEQIDNO: 1具有實質(zhì)同一性 (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性）的氨基酸序列，其中所述0臟 聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是除了D或EW外的任意氨基酸。在某 些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是除了DW外的 任意氨基酸。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨 基酸選自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDN0:1 的位置580對應(yīng)的氨基酸是G。
[0012] 在某些實施方案中，所述改進的DNA聚合酶包含與SEQIDNO: 1具有實質(zhì)同一性 (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性）的氨基酸序列，其中所述0臟 聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是除了IW外的任意氨基酸。在某些實 施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDN0:1的位置709對應(yīng)的氨基酸選自K、R、S、G和A。 在某些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是K。
[0013] 在某些實施方案中，所述改進的DNA聚合酶包含與SEQIDNO: 1具有實質(zhì)同一性 (例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性）的氨基酸序列，其中所述0臟 聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是除了M或外的任意氨基酸，與SEQ IDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是除了DW外的任意氨基酸，且與SEQIDNO: 1的位置 709對應(yīng)的氨基酸是除了IW外的任意氨基酸。因而，在某些實施方案中，所述改進的DM 聚合酶包含與SEQIDN0:1具有實質(zhì)同一性（例如，至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或95%同一性）的氨基酸序列，其中所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的 氨基酸是T，與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是G，且與SEQIDNO: 1的位置709 對應(yīng)的氨基酸是K。
[0014] 在某些實施方案中，與對照DNA聚合酶相比，所述改進的DNA聚合酶具有增加的逆 轉(zhuǎn)錄酶效率，任選地，沒有DNA依賴性的聚合酶活性的顯著下降，其中所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是除了M或IW外的任意氨基酸，且與SEQIDNO: 1 的位置709對應(yīng)的氨基酸是除了IW外的任意氨基酸，且其中除了所述對照DM聚合酶的 與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是M或IW外，所述對照DNA聚合酶具有與所述 DNA聚合酶相同的氨基酸序列，且與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是I。因而，在某 些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQIDN0:1的位置763對應(yīng)的氨基酸是T，且與SEQ IDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是K。在某些實施方案中，所述改進的DNA聚合酶進一步 包含在與SEQIDNO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸處的氨基酸置換。因而，在某些實施方案 中，所述DNA聚合酶的與SEQIDNO: 1的位置763對應(yīng)的氨基酸是除了M或IW外的任意 氨基酸，與SEQIDNO: 1的位置709對應(yīng)的氨基酸是除了 外的任意氨基酸，且與SEQID NO: 1的位置580對應(yīng)的氨基酸是除了D或EW外的任意氨基酸。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶的與SEQ