核苷酸序列及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明描述了來自己斯德畢赤酵母（P.pastoris)的山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子的鑒別 和分離，W及在所述分離的啟動(dòng)子的影響下，己斯德畢赤酵母中異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，具體地 人白蛋白（HA)和刺桐膜蛋白酶抑制劑巧TI)的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 己斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)是廣泛使用并且公認(rèn)的用于生產(chǎn)治療性重組 蛋白的工業(yè)宿主。治療性重組蛋白的生產(chǎn)具有幾個(gè)問題，如N末端（Pr油ha等人，2009)或 C末端的剪切，所需糖型（glyco化rm)的引入（WouterVervecken等人，2004)。需要提高蛋 白產(chǎn)率和質(zhì)量W滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求W及對(duì)生物相似性不斷增加的調(diào)控問題。該可W 通過共表達(dá)分子侶伴蛋白（Wei化ang等人，2006)、共表達(dá)蛋白酶W獲得所需的最終產(chǎn)物來 實(shí)現(xiàn)。在所有該些情況下，需要額外的啟動(dòng)子來進(jìn)行遺傳操作W改善重組蛋白的品質(zhì)和數(shù) 量。
[000引 美國(guó)專利No. 6033898公開了分離自釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)山梨 醇脫氨酶基因的DM部分，其用于提高異源多膚的產(chǎn)生。美國(guó)專利No. 5139936公開了含有 外源基因W及在適當(dāng)位置上的酵母半乳糖巧酶（GAL1)調(diào)控區(qū)和啟動(dòng)子的克隆載體W提高 外源基因的表達(dá)。美國(guó)專利No. 5089398公開了使用來自甘油醒-3-磯酸脫氨酶的啟動(dòng)子 區(qū)域控制酵母中外源多膚的表達(dá)。
[0004] 盡管對(duì)于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有幾種組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用，但是在大部 分研究和應(yīng)用中使用了A0X1。A0X1啟動(dòng)子是強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并且受碳源嚴(yán)格控制， 當(dāng)在存在除甲醇外的大部分其它碳源的情況下生長(zhǎng)己斯德畢赤酵母時(shí)，表達(dá)被高度抑 審IJ。甲醇是A0X1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑（imlucer)，由于其高可燃性和毒性，甲醇是危險(xiǎn)物品， 另外，依靠甲醇生長(zhǎng)的細(xì)胞具有很高的氧消耗，其通常需要加入純氧進(jìn)行培養(yǎng)，因此提 高了工藝成本并且限制了大規(guī)模培養(yǎng)能力（MonikaBollok等人，RecentPatentson biotechnology, 3(2009) 192-201)。
[0005] 另外，從依靠甲醇生長(zhǎng)的己斯德畢赤酵母釋放的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)化(P)很高，其 主要在細(xì)胞溶解期間獲得，但是當(dāng)用葡萄糖作為碳源生長(zhǎng)時(shí)，其程度要低得多。因此，細(xì)胞 維持更高的存活力和更高純度的分泌蛋白。
[0006] 此外，釀酒酵母（S.cerevisiae)中鑒別的山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子為75化P。由于較 大的堿基對(duì)大小，它不易于進(jìn)行遺傳操作，因?yàn)樗鼘?dǎo)致載體大小的增加。本發(fā)明旨在克服 上述問題。另外，在本領(lǐng)域中需要鑒別更多在己斯德畢赤酵母中用于異源重組蛋白表達(dá)而 不需要用于蛋白表達(dá)的任何特異性誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，本發(fā)明設(shè)及SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列；分離SEQIDNo. 1的方法，所 述方法包括W下行為（act) ;a)從己斯德畢赤酵母分離基因組DNA，b)擴(kuò)增在分離的基因組 DM內(nèi)包含SEQIDNo. 1的區(qū)域，和c)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)凝膠洗脫程序（conventional gelelutionproce化re)W分離所述SEQIDNo. 1;在包含非特異性誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基 (media)中在SEQIDNo. 1的調(diào)控（調(diào)節(jié)，regulation)下表達(dá)基因的方法，所述方法包括 W下行為；a)在SEQIDNo. 1下游的表達(dá)構(gòu)建體（expressionconstruct)中克隆所述基 因，b)用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主，和C)在包含非特異性誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中在所述SEQID No. 1的調(diào)控下表達(dá)所述基因W產(chǎn)生異源蛋白；包含如上所述的核巧酸序列的載體；包含如 上所述載體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
【附圖說明】
[000引圖1顯示了SDPHA/PMBL208的限制性酶切分析。所有消化產(chǎn)生了預(yù)期圖譜。
[0009] 圖 2 顯示了SDPHA/pMBL208 的載體圖。
[0010] 圖3顯示了在G418抗生素上選擇高重組蛋白產(chǎn)生菌（prcxlucer)的集落篩選。箭 頭所示的集落表示較高抗性的克隆。
[0011] 圖4顯示了己斯德畢赤酵母基因組中整合基因的PCR確認(rèn)。發(fā)現(xiàn)所有所選的克隆 具有所關(guān)注的基因。
[001引圖5顯示當(dāng)使用山梨糖醇作為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)HA的表達(dá)分析。
[001引圖6顯示當(dāng)使用甲醇作為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)HA的表達(dá)分析。
[0014] 圖7顯示當(dāng)使用葡萄糖作為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)HA的表達(dá)分析。
[0015] 圖8顯示沒有任何誘導(dǎo)的不含細(xì)胞的上清液的表達(dá)分析（細(xì)胞在擴(kuò)增培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)）。
[0016] 圖9顯示了ETI表達(dá)構(gòu)建體的圖片；A)在山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子的控制下，在化〇1 和E.coRI限制酶切位點(diǎn)中克隆ETI。B)上游無啟動(dòng)子的ETI。
[0017] 圖10顯示當(dāng)使用山梨糖醇作為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)ETI的表達(dá)分析。
[001引 圖11顯示不同碳源下ETI產(chǎn)率的確定。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明設(shè)及SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述核巧酸序列是山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子。
[0021] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核巧酸序列鑒別并分離自己斯德畢赤酵母。
[0022] 本發(fā)明設(shè)及SEQIDNo. 1的分離方法，所述方法包括W下行為；a)從己斯德畢赤 酵母分離基因組DNA，b)擴(kuò)增在分離的基因組DNA內(nèi)包含SEQIDNo. 1的區(qū)域，和C)對(duì)擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)凝膠洗脫程序W分離所述SEQIDNo. 1。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過SEQIDNo. 2所示的正向引物和SEQIDNo. 3 所示的反向引物進(jìn)行SEQIDNo. 1的擴(kuò)增。
[0024] 本發(fā)明設(shè)及在包含非特異性誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中在SEQIDNo. 1的調(diào)控下表達(dá)基因 的方法，所述方法包括W下行為；a)在SEQIDNo. 1下游的表達(dá)構(gòu)建體中克隆所述基因，b) 用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主，和C)在包含非特異性誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中在所述SEQIDNo. 1 的調(diào)控下表達(dá)所述基因W產(chǎn)生異源蛋白。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主是甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast)，優(yōu)選己斯德畢赤酵母。
[0026] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述異源蛋白選自包括W下的組；人白蛋白和刺 桐膜蛋白酶抑制劑。
[0027] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)是通過非特異性誘導(dǎo)劑進(jìn)行的。
[002引在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述非特異性誘導(dǎo)劑選自包括W下的組；山梨糖 醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、庶糖、淀粉、甲醇或它們的任意組合。
[0029] 本發(fā)明設(shè)及包含上述核巧酸序列的載體。
[0030] 本發(fā)明設(shè)及包含上述載體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0031] 本發(fā)明設(shè)及對(duì)山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子的鑒別，其作為在己斯德畢赤酵母中表達(dá)異源 重組蛋白的潛在工具，而不需要任何特異性表達(dá)誘導(dǎo)。
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，210bp啟動(dòng)子位于己斯德畢赤酵母的染色體1(1號(hào) 染色體）上。
[0033] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子是己斯德畢赤酵母中的最小 啟動(dòng)子。
[0034] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，鑒別山梨醇脫氨酶基因上游可用的啟動(dòng)子區(qū)具有位 于該區(qū)內(nèi)的CAAT和GC盒（框，box)。
[0035] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子成功用于表達(dá)重組蛋白，如人白蛋白 (HA)和刺桐膜蛋白酶抑制劑巧TI)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在山梨醇脫氨酶啟動(dòng) 子的控制下表達(dá)異源蛋白，如人白蛋白和刺桐膜蛋白酶抑制劑。
[0036] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子使異源蛋白能夠在任何類型 的碳源下表達(dá)。
[0037] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，山梨醇脫氨酶啟動(dòng)子使得能夠使用山梨糖醇、葡 萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、庶糖、淀粉和甲醇作為碳源表達(dá)異源蛋白。
[003引在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過W下方法鑒別來自己斯德畢赤酵母的山梨醇 脫氨酶基因；a)對(duì)山梨醇脫氨酶直系同源基因（genecxrtholog)進(jìn)行NCBIb