一株多菌靈降解菌mbc-6f及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的微細(xì)菌屬(Microbacterium),具體涉及一種能夠降解多菌靈(carbendazim，MBC )的微細(xì)菌MBC-6F及該菌對(duì)多菌靈的降解測(cè)定。
【背景技術(shù)】
[0002]多菌靈(carbendazim)，又名棉萎靈、貝芬替、苯并咪挫44號(hào)，英文商品名MBCjg對(duì)分子質(zhì)量為191.2，分子式為=C9H9N3O2，多菌靈是廣譜性殺菌劑，2011年以來(lái)，每年使用量約在4萬(wàn)噸，2012年其登記的產(chǎn)品數(shù)達(dá)857個(gè)，劑型包括原藥、粉劑、懸浮劑、可濕性粉劑、懸乳劑、種衣劑等近十種。在我國(guó)，多菌靈廣泛應(yīng)用于小麥、果樹(shù)、茶葉、蔬菜等病害的防治，還用于水果的采后保鮮。在農(nóng)業(yè)上，主要用于防治麥類赤霉病、水稻紋枯病、稻瘟病、菌核?。还麡?shù)和蔬菜的白粉病、炭疽病、黑星病、灰霉病等；種苗處理可防治禾谷類作物黑穗病和瓜類、番茄枯萎病等。工業(yè)上，多菌靈可用于紡織、造紙、皮革、橡膠等材料的防霉防腐。另外，苯菌靈、苯并咪唑類和托布津類殺菌劑在土壤中和作物體中也是通過(guò)轉(zhuǎn)化為多菌靈而起作用。
[0003]多年來(lái)大量連續(xù)使用內(nèi)吸性殺菌劑多菌靈，使得許多植物病菌對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性，如黃瓜灰霉病菌，油菜菌核病菌，番茄灰霉菌，稻瘟病菌，芒果炭疽病菌等。為了達(dá)到防治效果，農(nóng)民加大了施用量，致使土壤中多菌靈含量經(jīng)積累作用達(dá)到了很高的濃度，也導(dǎo)致了其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量嚴(yán)重超標(biāo)的問(wèn)題。我國(guó)GB18406.1-2001標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，蔬菜水果中多菌靈殘留量不得超過(guò)0.5mg/kg。2007年，歐盟委員會(huì)發(fā)布2007/12/EC指令，修訂了苯菌靈(Benomyl )、多菌靈(Carbendazim)、戊菌挫(Penconazole)三種殺菌劑的殘留限量，值得關(guān)注的是，多菌靈和苯菌靈在柑橘中的限量指標(biāo)由原來(lái)的5mg/kg修訂為0.05mg/kg，嚴(yán)格了100倍，食用菌類中的最大殘留限量由I mg/kg調(diào)整為0.1 mg/kg，嚴(yán)格了 10倍。由于多菌靈在環(huán)境中的穩(wěn)定性和長(zhǎng)期性，因此，通過(guò)自然迀移和生物鏈傳播，對(duì)土壤、植物、動(dòng)物和地下水生產(chǎn)了很大影響。尤其是飲用水和農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈污染超標(biāo)嚴(yán)重，已對(duì)直接或間接接觸多菌靈的人和動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。
[0004]多菌靈的毒性作用包括以下4方面:(I)致癌、致突變毒性:小鼠試驗(yàn)證實(shí)多菌靈會(huì)誘發(fā)小鼠肝臟癌變，然而結(jié)合其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)，植物科學(xué)委員會(huì)(Scientific Committeeon Plants)認(rèn)為由多菌靈引起小鼠肝臟腫瘤不足以得出多菌靈對(duì)人也有致癌作用的推論。但是，多菌靈確實(shí)對(duì)染色體具有致突變能力，有學(xué)者測(cè)驗(yàn)了多菌靈對(duì)人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多菌靈是一種作用很強(qiáng)的非整倍體劑，即使是在低劑量的情況下，也會(huì)影響染色體的數(shù)量。這是因?yàn)槎嗑`能抑制微管蛋白的聚合，而微管蛋白對(duì)細(xì)胞分裂中染色體的分離具有重要作用。(2)生殖毒性:多菌靈是一種內(nèi)分泌干擾素，能破壞哺乳動(dòng)物子宮發(fā)育，干擾成年鼠的精子和睪丸發(fā)育。研宄發(fā)現(xiàn)多菌靈作用劑量超過(guò)50mg/kg時(shí)，明顯可見(jiàn)大鼠睪丸的重量減輕、生精小管萎縮和輸精小管閉鎖。倘若大鼠在交配前接觸過(guò)多菌靈，雌性后代會(huì)表現(xiàn)出雄激素特性的發(fā)育毒性，如沒(méi)有陰道、子宮角不完全發(fā)育等，表明多菌靈的毒性作用可能與雄激素和雄激素受體依賴機(jī)制有關(guān)。(3)胚胎毒性:讓喂食多菌靈飼料60d的雄性小鼠與正常雌性小鼠交配，發(fā)現(xiàn)雖然雌性小鼠的受孕率和平均著床數(shù)沒(méi)有受到明顯影響，但死胎率有所增加。若使6~15d的孕鼠染上多菌靈，35mg/kg的劑量便可產(chǎn)生明顯的胚胎毒性，表現(xiàn)為吸收胎增多、活胎數(shù)減少、胎兒體重減輕，甚至胎兒畸形，若劑量增加到160mg/kg，則無(wú)胎兒形成。(4)其他毒性作用:多菌靈對(duì)蜜蜂無(wú)毒，對(duì)鳥類低毒。對(duì)魚類和其他水生生物有毒性，例如淡水魚、藍(lán)鰓太陽(yáng)魚、糠蝦和水生無(wú)脊椎動(dòng)物的LC5tl分別為
0.36mg/L、5.5mg/L、0.098mg/L和0.087mg/L。因?yàn)樗械某练e物會(huì)吸附多菌靈，所以毒性通常不會(huì)太高，但依賴沉積物生存的生物很可能會(huì)受到高劑量多菌靈的影響。土壤有機(jī)物對(duì)多菌靈有強(qiáng)烈的吸附作用，導(dǎo)致土壤中蚯蚓和線蟲數(shù)目減少。
[0005]多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、低于50 °C時(shí)至少可穩(wěn)定兩年；在堿性溶液中緩慢分解，隨PH值升高，分解加快，而在酸性溶液中穩(wěn)定。在水環(huán)境中可被紫外光解，而在土壤環(huán)境中，可與土壤顆粒不同程度的結(jié)合，主要靠微生物的降解，其半衰期在裸露的土壤中為6?12個(gè)月，在有植被的土壤中為3?6個(gè)月。微生物降解是目前有機(jī)農(nóng)藥殘留最主要的去除途徑。
[0006]我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，同時(shí)也是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，每年農(nóng)藥的使用量達(dá)50萬(wàn)t，其中約有80%的農(nóng)藥直接進(jìn)入環(huán)境，受農(nóng)藥污染的耕地面積至少有1300~1600萬(wàn)公頃。分離和篩選高效農(nóng)藥降解菌，將有助于解決土壤農(nóng)藥污染嚴(yán)重的問(wèn)題，減少通過(guò)地表徑流或農(nóng)田滲漏形成的農(nóng)藥對(duì)水環(huán)境的污染，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，促進(jìn)我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)存多菌靈降解微生物的數(shù)量局限性，本發(fā)明的目的在找到一種對(duì)多菌靈具有高效降解效率的新多菌靈降解菌，它能有效的降解多菌靈，為多菌靈農(nóng)藥殘留問(wèn)題的解決奠定了基礎(chǔ)，也為多菌靈高效降解酶的研發(fā)提供材料。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種能夠有效降解多菌靈的多菌靈降懷售[Microbacterium sp.MBC-6F，于2014年12月31日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為:CCTCC NO:M 2014680，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0009]1、多菌靈降解菌的篩選、分離與純化。
[0010]取新鮮的土樣樣品于以多菌靈為唯一碳源的富集培養(yǎng)基，周期性的提高多菌靈濃度至300 mg/L，進(jìn)行富集馴化培養(yǎng)，取KT1?10 _n梯度稀釋的馴化富集培養(yǎng)液進(jìn)行菌的分離純化培養(yǎng)，得土壤中的多菌靈降解菌純化菌種MBC-6F。
[0011]2、多菌靈降解菌MBC-6F的鑒定。
[0012]通過(guò)5000倍掃描電鏡對(duì)多菌靈降解菌MBC-6F的微觀形態(tài)學(xué)進(jìn)行了鑒定。MBC-6F的16S rDNA分子學(xué)鑒定委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行。鑒定結(jié)果應(yīng)用ClustalX 1.83 vers1n和MEGA 4.0軟件采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0013]3、多菌靈降解菌對(duì)多菌靈的降解測(cè)定。
[0014]以5%的接種量接種純化的多菌靈降解菌MBC-6F于降解培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣后進(jìn)行HPLC-MS測(cè)定，通過(guò)多菌靈的含量測(cè)定確定多菌靈降解菌MBC-6F對(duì)多菌靈的降解效率，并進(jìn)一步確定多菌靈降解菌MBC-6F對(duì)多菌靈的降解產(chǎn)物。
[0015]4、多菌靈降解菌的降解條件探討。
[0016]用單因素法分別分析了多菌靈降解菌MBC-6F在不同溫度，酸度及接種量梯度變化條件下對(duì)多菌靈的降解情況。探討多菌靈降解菌MBC-6F對(duì)多菌靈的最優(yōu)降解條件。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1多菌靈降解菌MBC-6F菌株的單個(gè)菌落形態(tài)照片；
圖2多菌靈降解菌MBC-6F 5000倍掃描電鏡照片；
圖3利用MEGA軟件構(gòu)建多菌靈降解菌MBC-6F系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)圖；
圖4 MBC-6F菌降解多菌靈的降解產(chǎn)物質(zhì)譜圖；
圖5 MBC-6F菌對(duì)多菌靈的降解率；
圖6溫度對(duì)MBC-6F降解多菌靈的影響；
圖7pH對(duì)MBC-6F降解多菌靈的影響；
圖8接種量對(duì)MBC-6F降解多菌靈的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合發(fā)明人給出的附圖和具體試驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明
1、多菌靈降解菌的篩選、分離與純化:
(I)供試樣品:2013年5月采樣與西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院連續(xù)施用多菌靈的溫室大棚土壤。
[0019](2)培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基:NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,加入蒸餾水100mL,調(diào)節(jié)pH值為7.0。