保存，進(jìn)行后續(xù)實驗。
[0020]將降解菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，其配方為:哌嗪5g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,瓊脂20.00g/L, pH7.0, 30°C恒溫培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)，用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)(1000X)。其結(jié)晶紫染色照片如圖1所示。生物學(xué)特性為革蘭氏染色陰性，菌落光滑，短桿狀，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原酶陰性。菌株的生理生化鑒定按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。鑒定為乙酸媽不動桿菌屬(
calcoaceticus );命名為:N0R_36。
[0021]實施例2乙酸鈣不動桿菌N0R-36的搖瓶降解實驗
2.1接種量對N0R-36降解效率的影響
在含500ug/L諾氟沙星的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其配方為:每升含500ug/L哌嗪，1.50 gK2HP04、0.50g KH2P04、0.20g MgSO4X 7H20、1.00g NaCl,1.00g (NH4)2SO4, pH 7.0，按1%、2%、3%、4%、5%、的接種量接種N0R-36于培養(yǎng)液中，于30°C振蕩培養(yǎng)，72小時取樣測定。結(jié)果由圖2可以看出，按1%進(jìn)行接種時，降解率為91%，隨著接種量的提高，諾氟沙星降解率有小幅增加，考慮到菌體生長和經(jīng)濟(jì)的原因，采用1%的接種量即可達(dá)到要求。
[0022]2.2 pH對N0R-36降解效率的影響
PH值是影響微生物生長和生存的另一個重要環(huán)境因素，微生物生長有一個適宜的pH值范圍，超過適宜生長的PH值范圍，大多數(shù)微生物都不能很好人的生長。
[0023]在含500ug/L諾氟沙星的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其配方為:每升含500ug哌嗪，1.50 gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4X 7H20、1.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4, pH 7.0，按 1% 的接種量接種NOR-36于培養(yǎng)液中，pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0，于30°C振蕩培養(yǎng)，72小時取樣測定。結(jié)果由圖3可以看出，pH過高或過低都會影響N0R-36對諾氟沙星的降解，最優(yōu)PH范圍為7。
[0024]實施例3含有乙酸鈣不動桿菌N0R-36菌劑的制備
將實施例1篩選和分離的諾氟沙星降解乙酸鈣不動桿菌N0R-36的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml含哌嗪的LB培養(yǎng)基的100rnl搖瓶中，LB培養(yǎng)基配方為:哌嗪5g/L，酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl10.00g/L，pH 7.0，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為:哌嗪 5g/L，葡萄糖 8g/L，(NH4) 2S04 lg/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCllg/L%，CaCO3 0.5g/L，酵母膏2g/L，pH值7.2-7.5。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1:0.8。將到達(dá)對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.lkg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在35°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1: 1.2，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個工藝流程培養(yǎng)時間為60小時。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0025]實施例4諾氟沙星降解菌效果驗證配制人工廢水，其組成如下:葡萄糖2.5g/L，氯化鈉lg/L，硫酸銨0.5g/L，磷酸二氫鉀
0.lg/L。取2個相同的反應(yīng)器(5L)分別編號為1#和2#，向2個反應(yīng)器中分別加入4L上述人工廢水，并同時接種400ml活性污泥。向1#反應(yīng)器中加入500ml滅活的菌液，向2#反應(yīng)器中加入500ml未滅活的菌液，每隔2h取樣，測定廢水中的化學(xué)需氧量(COD)濃度。結(jié)果見圖4，在諾氟沙星降解菌存在的條件下可以消除諾氟沙星對活性污泥的抑制作用，顯著降低人工廢水的化學(xué)需氧量。
【主權(quán)項】
1.一株諾氟沙星降解乙酸媽不動桿菌(Acinetobacter.菌株N0R-36，其保藏編號為CGMCC N0.10540。
2.權(quán)利要求1所述的乙酸鈣不動桿菌NOR-36在諾氟沙星降解中的應(yīng)用。
3.含有權(quán)利要求1所述的乙酸鈣不動桿菌NOR-36的菌劑。
4.權(quán)利要求3所述菌劑在諾氟沙星降解中的應(yīng)用。
5.含有權(quán)利要求1所述的乙酸鈣不動桿菌NOR-36的菌劑的制備方法，其特征在于，包括:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，具體為: 將諾氟沙星殘留的乙酸鈣不動桿菌NOR-36的試管種接種于添加哌嗪的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期； 將步驟I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即種子液； 3)將步驟2)所述種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為:NaCl10.00g/L,蛋白胨 10.00g/L,酵母粉 5.00g/L,哌嗪 5g/L，pH7.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:哌嗪 5g/L，葡萄糖 8g/L，(NH4) 2S04 lg/L, K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl lg/L%，CaCO30.5g/L，酵母膏 2g/L，pH 值 7.2-7.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述種子罐和步驟3)所述的生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35°C，步驟2和3的整個工藝流程培養(yǎng)時間為48-60小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)所述菌劑直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種消除廢水中諾氟沙星殘留的降解菌劑，屬于生物高科技技術(shù)領(lǐng)域。所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌NOR-36，經(jīng)鑒定為乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter.calcoaceticus）。于2015年2月9日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101），保藏編號CGMCC NO.10540，經(jīng)鑒定是乙酸鈣不動桿菌。主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陰性，菌落光滑，短桿狀，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原酶陰性。降解菌產(chǎn)品直接施用可使水中諾氟沙星殘留量降低90％上。CGMCC No.1054020150209
【IPC分類】C12N1-20, C02F3-34, C02F101-38, C12R1-01
【公開號】CN104862253
【申請?zhí)枴緾N201510264456
【發(fā)明人】蔡天明, 陳立偉, 楊倩, 蔡舒
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月22日