34] 圖4是實(shí)施例4中加微生物菌劑與未加微生物菌劑的油菜體內(nèi)硝酸鹽濃度對比 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下實(shí)施例用于對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0036] 實(shí)施例1目標(biāo)菌種的篩選分離
[0037] (1)培養(yǎng)基制備
[0038] 富集培養(yǎng)基：KN0310g，KCl lg，MgSO4 · 7H20 0· 5g，CaCl2lmg，F(xiàn)eSO4 · 7H20 10mg， KH2P040.5g 葡萄糖 7.5g，去離子水 lL，pH 7.0。高壓滅菌：121°C，20min。
[0039] 分離培養(yǎng)基：KN0310g，KCl lg，MgSO4 · 7H20 0· 5g，CaCl2lmg，F(xiàn)eSO4 · 7H20 10mg， KH2P040.5g，葡萄糖 7.5g，瓊脂 15g，去離子水 lL，pH 7.0。高壓滅菌：121°C，20min。
[0040] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去離子水1L，pH 7· 0。高壓 滅菌：121°C，20min。
[0041] (2)硝酸鹽轉(zhuǎn)化菌的富集與分離
[0042] 1)轉(zhuǎn)化菌的富集培養(yǎng)
[0043] 采用搖瓶富集培養(yǎng)的方法。以硝酸鉀為唯一的氮源。具體步驟如下：土樣各取 l〇g，于IOOmL富集培養(yǎng)基中，置于25°C，120r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，以后每隔一周移種一 次。之后以接種量的10%接入新鮮富集培養(yǎng)液中，如此反復(fù)多次馴化。
[0044] 2)轉(zhuǎn)化菌的分離純化
[0045] 采用平板劃線法，在分離培養(yǎng)基上對經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行純化培養(yǎng)。
[0046] 挑取生長比較好的菌落，在LB培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離純化3~4次，得到純化好的 轉(zhuǎn)化菌株，篩選能以硝酸鉀為唯一氮源生長的菌株。
[0047] 3)轉(zhuǎn)化菌的篩選
[0048] 將純化好的轉(zhuǎn)化菌株接種于LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18h后，用無菌水制成菌懸液，接種 0.1 mL菌懸液于IOmL的富集培養(yǎng)液中，30°C，120r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，48h后，檢驗(yàn)液體中 硝態(tài)氮的含量，選取幾株轉(zhuǎn)化量最高的菌。綜合生長速度、硝酸鹽轉(zhuǎn)化效率等特點(diǎn)，選取菌 株SrN7作為目標(biāo)菌株。
[0049] 實(shí)施例2目標(biāo)菌種短小芽孢桿菌SrN7的鑒定
[0050] (1)分子生物學(xué)鑒定
[0051] SrN7菌株的分子生物學(xué)鑒定
[0052] 將保存的SrN7細(xì)菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，30°C，180r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)過夜 培養(yǎng)，所得菌液用上海生工生物細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，擴(kuò)增該菌株的16S rDNA，將 獲得的PCR產(chǎn)物純化后委托華大基因進(jìn)行測序。
[0053] PCR擴(kuò)增引物為通用引物：
[0054] 27F :5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQ ID NO :2)
[0055] 1492R :5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（SEQ ID NO :3)。
[0056] PCR擴(kuò)增體系采用25 μ 1反應(yīng)體系，如表1所示。
[0057] 表1 PCR擴(kuò)增體系
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種土壤硝酸鹽轉(zhuǎn)化細(xì)菌，其特征在于，分類命名為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，菌株號為 SrN7,保藏號為 CGMCC No. 9685。
2. -種由權(quán)利要求1所述土壤硝酸鹽轉(zhuǎn)化細(xì)菌制成的微生物菌劑。
3. -種如權(quán)利要求2所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將權(quán)利要求1中保藏號為CGMCC No. 9685的短小芽孢桿菌SrN7活化及擴(kuò)大培養(yǎng)， 然后將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)； (2) 將步驟（1)中發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌液過濾得到菌體，將所得菌體以質(zhì)量比為1~ 3:10的比例與麩皮混合均勻即可。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如 下： 淀粉0.2%，葡萄糖1.5%，硫酸錳0. 1%，磷酸氫二鉀0.3%，磷酸二氫鉀0. 15%，硫酸 鎂0. 05 %，酵母膏0. 02 %，氯化鐵0. 01 %，碳酸鈣0. 01 %，大豆柏3 %。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟（1)中發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：36~ 38°C，150~200r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)34~38小時(shí)。
6. -種降低設(shè)施栽培條件下蔬菜硝酸鹽含量的方法，其特征在于，將由權(quán)利要求1所 述土壤硝酸鹽轉(zhuǎn)化細(xì)菌制成的微生物菌劑施用于目標(biāo)蔬菜根部的土壤中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，目標(biāo)蔬菜的生長周期內(nèi)，間隔施用所述微生 物菌劑，每次施加的微生物菌劑的質(zhì)量與目標(biāo)土壤的質(zhì)量比為3~8:1000。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述目標(biāo)蔬菜為油菜。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，油菜幼苗移栽時(shí)向油菜根部的土壤中施加 第一次微生物菌劑，間隔一個(gè)月后施加第二次微生物菌劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述油菜幼苗為種植20~25天時(shí)的幼苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低設(shè)施栽培條件下蔬菜硝酸鹽含量的方法，從設(shè)施種植多年的大棚土壤中分離一株土壤硝酸鹽轉(zhuǎn)化細(xì)菌，分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，菌株號為SrN7，保藏號為CGMCC No.9685。將該微生物菌株經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)及發(fā)酵處理后與麩皮混合制成微生物菌劑，將所得微生物菌劑施加在目標(biāo)蔬菜根部的土壤中。本發(fā)明得到的菌劑為純生物制劑，對身體及環(huán)境健康無害，能夠降低設(shè)施土壤中硝酸鹽濃度，從而降低蔬菜體內(nèi)硝酸鹽含量，并能夠促進(jìn)植物生長，改善土壤基本理化性質(zhì)，相對于其他降低設(shè)施土壤硝酸鹽的方法，該發(fā)明可在不影響正常生產(chǎn)的前提下，邊生產(chǎn)邊降低土壤中硝酸鹽含量，達(dá)到邊生產(chǎn)邊修復(fù)的效果。CGMCC No.968520140919
【IPC分類】C09K17-00, C12R1-07, A01P21-00, C12N1-20, A01N63-00, C09K101-00
【公開號】CN104862255
【申請?zhí)枴緾N201510277724
【發(fā)明人】潘風(fēng)山, 馮英, 楊肖娥, 孟茜, 羅莎, 陳寶, 凱蘭, 唐琳
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月26日