熱穩(wěn)定堿性果膠酶突變體及其編碼基因以及它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種果膠酶蛋白，所述果膠酶蛋白的編碼基因，含有該編碼基因的重 組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，含有所述果膠酶蛋白作為活性成分的組合物，以及如上所述的果膠 酶蛋白、編碼基因、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和組合物在水解果膠中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 果膠質(zhì)是一種酸性多糖物質(zhì)，廣泛存在于植物界，主要存在于植物的細(xì)胞初生壁 和細(xì)胞中間層，為內(nèi)部細(xì)胞的支撐物質(zhì)。果膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，果膠的主鏈?zhǔn)遣糠旨柞?化的半乳聚糖，支鏈依據(jù)果膠質(zhì)來源的不同而改變。去酯化的果膠被稱作果膠酸或者多 聚半乳糖醛酸。水解這類果膠物質(zhì)的酶被廣泛稱作果膠酶。內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶 (EC. 4. 2. 2. 2)是通過β消除作用隨機(jī)裂解果膠酸的α-1，4-糖苷鍵將其降解。堿性果膠 酶可應(yīng)用于一些傳統(tǒng)的工業(yè)過程，如紡織和植物纖維處理、咖啡和茶業(yè)發(fā)酵、油料提取、含 有果膠物質(zhì)的工業(yè)廢水處理。由于微生物酶法在生物精煉及植物纖維脫膠等處理過程比傳 統(tǒng)的化學(xué)處理具有明顯的優(yōu)勢，它能夠減少化學(xué)處理過程中采用高濃度的強(qiáng)堿溶液對(duì)植物 纖維的損害及后期污水的處理，因而也引起越來越多的研究。
[0003] 酶學(xué)特性和酶的穩(wěn)定性是影響其應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。由于脫膠的過程多數(shù)是在 堿性和較高溫度條件下進(jìn)行的，也就要求了參與這過程中的酶要必須要能耐受較高的溫度 和堿性。其中酶的熱穩(wěn)定性對(duì)于工業(yè)應(yīng)用來說十分重要，而且高溫條件下，酶的反應(yīng)速度更 快，能縮短反應(yīng)周期，節(jié)約成本，也有利于避免反應(yīng)過程中被其他微生物污染。
[0004] 從嗜堿芽孢桿菌BaciIIus sp. Ν16-5 (CGMCC N0.0 369)克隆得到的果膠酶 Bspl65PelA具有活性高，最適反應(yīng)pH高，同時(shí)它并不需要額外添加 Ca2+就能保持活性，在 生物脫膠等方面具有較大的工業(yè)應(yīng)用潛力，但由于其熱穩(wěn)定性不理想，50°C保溫30min就 基本喪失了活性，提高其熱穩(wěn)定性具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有果膠酶不能夠耐高溫的缺陷，提供了一種耐高溫的 果膠酶蛋白及其編碼基因，另外，還提供了含有編碼所述果膠酶蛋白的基因的重組載體、細(xì) 胞，以及含有所述果膠酶蛋白的組合物，以及它們的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種果膠酶蛋白，其中，所述果膠酶蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID No :5或SEQ ID No :6所示。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼基因，其中，所述編碼基因能夠編碼如上所述的 果膠酶蛋白。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，其中，所述重組載體含有如上所述的編碼 基因。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有如上所述的 編碼基因。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其中，所述組合物含有如上所述的果膠酶蛋 白作為活性成分。
[0011] 第六方面，本發(fā)明提供了如上所述的果膠酶蛋白、如上所述的編碼基因、如上所述 的重組載體、如上所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、如上所述的組合物在水解果膠中的應(yīng)用。
[0012] 通實(shí)施例可以看出，本發(fā)明提供的果膠酶蛋白的熱穩(wěn)定性能明顯得到了提高。
[0013] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0014] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0015] 圖1顯示了果膠酶蛋白突變體以及野生型果膠酶蛋白在50°C下保溫不同時(shí)間的 殘余酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0017] 第一方面，本發(fā)明提供了一種果膠酶蛋白，其中，所述果膠酶蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No :5 (表示為 2B9)或 SEQ ID No :6 (表示為 EA)所示。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，所述果膠酶蛋白的來源沒有特別的限制，只要能夠獲得如上氨基酸 序列的果膠酶蛋白即可。例如，所述果膠酶蛋白可以由人工合成獲得，也可以通過該果膠酶 蛋白的氨基酸序列獲得其編碼基因，然后再進(jìn)行相應(yīng)的生物表達(dá)獲得。
[0019] 基于此，本發(fā)明提供了一種編碼基因，其中，所述編碼基因能夠編碼如上所述的果 膠酶蛋白。
[0020] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，遺傳密碼子具有簡并性，因此，在了解如上果膠酶蛋白的氨 基酸序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)的技術(shù)手段能夠獲得核苷酸序列不同的、且 能夠編碼如上果膠酶蛋白的編碼基因。
[0021] 優(yōu)選的情況下，編碼SEQ ID No :5的基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示、編碼 SEQ ID No :6的基因的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
[0022] 其中，編碼野生型果膠酶蛋白SEQ ID No :4 (表示為WT)的基因的核苷酸序列如 SEQ ID No :1 所示。
[0023] 第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，其中，所述重組載體含有如上所述的編碼 基因。
[0024] 第四方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有如上所述的 編碼基因。
[0025] 所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞優(yōu)選為原核細(xì)胞，更優(yōu)選為大腸桿菌。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以用于所述果膠酶蛋白的制備，具體地， 所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以為大腸桿菌，可以在35-40°C的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)OD值達(dá)到0. 6左右 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)。所述誘導(dǎo)劑通常為異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，其終濃 度例如可以為0. 8-1. 2mM。
[0027] 第五方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其中，所述組合物含有如上所述的果膠酶蛋 白作為活性成分。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，所述組合物中所述果膠酶蛋白的濃度沒有特別的限制，可以根據(jù)具 體的情況進(jìn)行具體的選擇，在此不再詳細(xì)贅述。
[0029] 另外，根據(jù)預(yù)定的用途不同，本發(fā)明提供的組合物可以制備為不同的劑型，并且添 加有相應(yīng)的賦形劑等成分。具體的選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再詳細(xì)贅述。
[0030] 第六方面，本發(fā)明提供了如上所述的果膠酶蛋白、如上所述的編碼基因、如上所述 的重組載體、如上所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、如上所述的組合物在水解果膠中的應(yīng)用。
[0031] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0032] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件進(jìn)行，例如《分子克?。?實(shí)驗(yàn)室手冊》中所述的條件，或按照相應(yīng)生物學(xué)試劑的制造廠商所建議的條件。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 易錯(cuò)PCR方法構(gòu)建果膠酶突變文庫
[0035] 首先采用 PCR 方法（pelA 上游引物序列為：5' -GTGCGCTAGCATGGGACG-3'，如 SEQ ID No :9 所示；pelA 下游引物序列為 5' -GCGAAGCTTTCATCGATTTG-3'，如 SEQ ID No :10 所示）從嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp. N16-5 (CGMCC N0.0 369)基因組擴(kuò)增獲得果膠酶 Bspl65PelA基因 pelA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-pelA。再以pET28a-pelA為模板，利用易錯(cuò) PCR技術(shù)在體外向pelA引入核苷酸突變。隨機(jī)突變引物序列為如SEQ ID No :7 (MegaF : 5'-GCGGCAGCCATATGGCTAGCT-3^PSEQIDNo:8(MegaR:5'-GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTC-3) 所示。
[0036] 擴(kuò)增體系為：
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種果膠酶蛋白，其特征在于，所述果膠酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :5或SEQ ID No :6 所示。
2. -種編碼基因，其特征在于，所述編碼基因能夠編碼權(quán)利要求1所述的果膠酶蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其中，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No: 2 或 SEQ ID No :3 所示。
4. 一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求2所述的編碼基因。
5. -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的編碼基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為原核細(xì)胞。
7. -種組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1所述的果膠酶蛋白作為活性 成分。
8. 權(quán)利要求1所述的果膠酶蛋白、權(quán)利要求2所述的編碼基因、權(quán)利要求4所述的重組 載體、權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、權(quán)利要求7所述的組合物在水解果膠中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種果膠酶蛋白，其中，所述果膠酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：6所示。另外，本發(fā)明還提供了含有該編碼基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，含有所述果膠酶蛋白作為活性成分的組合物，以及如上所述的果膠酶蛋白、編碼基因、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和組合物在水解果膠中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的果膠酶蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性和活性。
【IPC分類】C12N15-63, C12N1-21, C12N15-60, C12N9-88
【公開號(hào)】CN104862295
【申請?zhí)枴緾N201410067267
【發(fā)明人】馬延和, 葉金統(tǒng), 周成, 薛燕芬
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2014年2月26日