玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因clf、其檢測方法及應(yīng)用
【專利說明】
[0001]一、技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及的是植物保護領(lǐng)域，具體涉及的是玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF、其檢測方法及應(yīng)用。
[0002]二、【背景技術(shù)】:
由新月彎孢引起的玉米彎孢葉斑病曾在1990年代在我國北方玉米產(chǎn)區(qū)大發(fā)生，造成嚴重的產(chǎn)量損失，隨后不斷蔓延至全國，成為玉米生產(chǎn)上的重要病害。由于目前藥劑防治效果較差，防治該病主要以推廣抗病品種為主。然而，研宄發(fā)現(xiàn)玉米彎孢葉斑病菌存在明顯的生理分化和致病性變異，一旦抗病品種喪失抗性，將直接威脅玉米生產(chǎn)安全。
[0003]玉米彎孢葉斑病菌在自然界中主要以無性繁殖為主，其無性階段產(chǎn)生的分生孢子通過接觸寄主萌發(fā)侵入寄主，在寄主中擴展、繁殖、產(chǎn)生大量的分生孢子。分生孢子可借助界質(zhì)形成再侵染和循環(huán)。分生孢子是該病害發(fā)生和流行的主要影響因子。
[0004]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的一個目的是提供玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF，這種玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF用于解決玉米彎孢葉斑病的問題；本發(fā)明的另一個目的是提供這種玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的檢測方法，以及這種玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:這種玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]上述方案中所述的基因CLF編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]上述方案中玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的堿基序列有3個外顯子，分別位于SEQ.1Dl的5端第I位至198位堿基之間、第252位至324位堿基之間、第379位至2987位堿基之間。
[0008]上述玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的檢測方法:根據(jù)玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的編碼區(qū)序列設(shè)計引物，檢測CLF基因的表達；CLF正向引物:5' -TCATACCTTCACTCACGGGACA-3'，CLF 反向引物:GCAACCGAGGGACCAAAT。
[0009]上述玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF用于控制玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性。
[0010]上述玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的表達與其蛋白的表達、修飾與定位作為重要候選基因用于抗真菌藥劑的篩選和設(shè)計中。
[0011]上述玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF用于控制玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性功能的檢測方法:
一、通過同源重組方法構(gòu)建玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的缺失突變體，構(gòu)建的突變體由PCR驗證CLF基因已被潮霉素抗性基因替換，且檢測不到CLF基因的表達，獲得CLF基因敲除突變體；
二、采用基因互補方法將包括CLF基因起始密碼子ATG前2000bpDNA和CLF基因通過原生質(zhì)方法轉(zhuǎn)入CLF基因敲除突變體中，且檢測到CLF基因的表達，獲得CLF互補突變體；
三、將野生型菌株、CLF基因敲除突變體和CLF互補突變體轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，觀察其產(chǎn)孢和致病性情況，結(jié)果表明該基因的缺失導(dǎo)致玉米彎孢葉斑病菌不產(chǎn)孢；CLF缺失突變體產(chǎn)生的致病斑大小略小于野生型菌株；通過基因互補可以恢復(fù)CLF缺失突變體的產(chǎn)孢和致病性，綜合以上結(jié)果，說明CLF基因可以調(diào)控玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性。
[0012]有益效果:
本發(fā)明提供的CLF基因，可用于玉米彎孢葉斑病菌的調(diào)控，通過抑制病菌分生孢子產(chǎn)生和降低其致病性，有效的阻止病害傳播、發(fā)生與危害，為創(chuàng)建持久，有效防治技術(shù)提供技術(shù)支持。
[0013]四、【附圖說明】:
圖1:CLF基因敲除示意圖(A)和互補載體構(gòu)建示意圖(B):CLF-F代表CLF基因5'端，CLF-R代表CLF基因3'端。
[0014]圖2:CLF基因敲除突變體(A)與野生型菌株⑶產(chǎn)孢比較圖五、【具體實施方式】:
下面對本發(fā)明做進一步的說明:
這種玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]該基因CLF編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的堿基序列有3個外顯子，分別位于SEQ.1Dl的5端第I位至198位堿基之間、第252位至324位堿基之間、第379位至2987位堿基之間。
[0016]玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的檢測方法:根據(jù)玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的編碼區(qū)序列設(shè)計引物，檢測CLF基因的表達；CLF正向引物:5' -TCATACCTTCACTCACGGGACA-3'，CLF 反向引物:GCAACCGAGGGACCAAAT。
[0017]具體如下:
I)根據(jù)CLF編碼序列設(shè)計引物:CLF正向引物:5'-TCATACCTTCACTCACGGGACA-3'，CLF反向引物:GCAACCGAGGGACCAAAT 。
[0018]2)總RNA的提取和cDNA合成:
①研缽中加入液氮，充分冷卻，加入放置于液氮中的菌絲或孢子，待液氮即將揮發(fā)干時快速研磨，反復(fù)研磨3次。
[0019]②將研磨好的樣品加入到RNAse free的預(yù)冷的2.0ml EP管中，在超凈工作臺中向EP管中加入900 μ I的Bizol，斡旋混勻，將EP管于冰中冰浴15min。
[0020]③冰浴后向EP管中加入800 μ1 ρΗ〈5.0的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，劇烈搖晃并懸浮，再冰浴lOmin。
[0021]④冰浴后，將EP管于預(yù)冷的離心機中12000rpm 4°C離心15min ;將離心后的上清用槍頭小心吸出轉(zhuǎn)移至新的2ml RNAse free EP管中，再加入800 μ I ρΗ>7.8的酸:氯仿:異戊醇(25:24:1)，輕搖，上下顛倒10次，再冰浴1min ;冰浴后再次12000rpm 4°C離心15min，將上清吸入新的2mlRNase free EP管中，加入800 μ I氯仿，搖晃幾十下后冰浴5min ;冰浴后再12000rpm 4°C離心15min，將上清吸入1.5ml RNAse free EP管中，加入800 μ I異丙醇，室溫沉淀30min或者_20°C過夜。
[0022]⑤12000rpm 4°C離心15min后棄上清，用800 μ I 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，將沉淀用手指輕輕彈起，靜置5min ；12000rpm 4°C離心15min后棄上清，用800 μ I無水乙醇洗滌沉淀，將沉淀用手指輕輕彈起，靜置5min ；12000rpm 4°C離心15min后棄上清，用槍頭將多余液體吸凈，于冰中在超凈工作臺中干燥1min。
[0023]⑥在37°C中去用RNAse free DNAase除DNA，然后進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0024]⑦取RNA 3μ I 于 Rnase free PCR 管中，加入 olig dT I μ 1，最后用 DEPC 水補至12 μ I。 將PCR管放置于65°C PCR儀器中5min后，取出PCR管置于冰中5min ;取出S冰浴后的 PCR 管加入 5XReact1n Buffer 4 μ I, Inhibitor I μ l,reversase I μ 1，1mMdNTPs 2 μ 1，再將 PCR管置于 PCR儀中完成 42°C 60min ；72°C 1min ；16°C forever 的程序后即得到cDNA。
[0025]3)PCR 擴增和檢測。以 2XTaq master mix 2(^1，模板。0嫩 2 yl、CLF 正向引物和CLF反向引物各2 μ 1，加ddH20補至50 μ I。PCR擴增程序:94°C 3 min ；94°C 30sec，55°C 30 sec, 72°C I min，30個循環(huán)；72°C 10 min ；16°C反應(yīng)結(jié)束。用1%濃度的瓊脂糖進行凝膠電泳來檢測PCR擴增情況。
[0026]玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF缺失、突變或修飾后導(dǎo)致基因不表達，達到控制玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性，用于控制玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性。
[0027]玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的表達與其蛋白的表達、修飾與定位作為重要候選基因用于抗真菌藥劑的篩選和設(shè)計中。篩選能夠阻止該基因表達與其蛋白質(zhì)的表達、修飾與定位的化合物，可以有效控制玉米彎孢葉斑病菌分生孢子的產(chǎn)生和致病性，可以作為新型殺菌劑的候選新藥物直接利用。
[0028]上述玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF用于控制玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性功能的檢測方法:
一、通過同源重組方法構(gòu)建玉米彎孢葉斑病菌產(chǎn)孢基因CLF的缺失突變體，構(gòu)建的突變體由PCR驗證CLF基因已被潮霉素抗性基因替換，且檢測不到CLF基因的表達，獲得CLF基因敲除突變體；
二、采用基因互補方法將包括CLF基因起始密碼子ATG前2000bpDNA和CLF基因通過原生質(zhì)方法轉(zhuǎn)入CLF基因敲除突變體中，且檢測到CLF基因的表達，獲得CLF互補突變體；
三、將野生型菌株、CLF基因敲除突變體和CLF互補突變體轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，觀察其產(chǎn)孢和致病性情況，結(jié)果表明該基因的缺失導(dǎo)致玉米彎孢葉斑病菌不產(chǎn)孢；CLF缺失突變體產(chǎn)生的致病斑大小略小于野生型菌株；通過基因互補可以恢復(fù)CLF缺失突變體的產(chǎn)孢和致病性，綜合以上結(jié)果，說明CLF基因可以調(diào)控玉米彎孢葉斑病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性。
[0029]I)基因敲除盒構(gòu)建:
①基因敲除采用同源重組的方法，用潮霉素基因替換玉米彎孢葉斑病菌CLF基因的編碼區(qū)。左臂正反引物分別為 CLFIs (5'-GCTCTAGATAGAAGCAGGAGACGAAGTG-3' )和 CLFlA (5' -CATTGATGTGTTGACCTCCTGCGAGTGAGGGTGAAAGG-3'),右臂正反引物分別為 CLF2S(5'-CGGAATCCGGCTTTGACGCATTTGAC-3')和 CLF2A (5'-CGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGTACGGTGTTTGGCAGTCC-3')，擴增模板為玉米彎孢葉斑病菌的總DNA，擴增目的片段大小分別為926bp和992bp。潮霉素正反方向引物分別為hphl (5' -GGAGGTCAACACATCAATG-3' )和hph2(5' -CTACTCTATTCCTTTGCCCTCG-3' )，擴增模板為質(zhì)粒pBHtl，擴增目的片段大小為1347bp。通過融合PCR方法，左右兩臂按照上下游順序分別融合到潮霉素基因AM的兩側(cè)，構(gòu)建基因