一種用于指導(dǎo)鉑類藥物用藥的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于指導(dǎo)鉬類藥物用藥的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)階段臨床上進(jìn)行化學(xué)藥物治療常見的難題是腫瘤耐藥和化療藥物的毒副反應(yīng)。 化療未來的發(fā)展方向是實(shí)現(xiàn)根據(jù)腫瘤的反應(yīng)以及宿主毒副反應(yīng)的個(gè)體化治療模式。鉬類抗 癌藥物(主要指順鉬、卡鉬和奧沙利鉬；順鉬的全稱為順式-二氯二氨合鉬，卡鉬的全稱為 順二氨環(huán)丁烷鉬，奧沙利鉬的全稱為左旋反式二氨環(huán)已烷草酸鉬）是目前臨床應(yīng)用中對多 種癌癥具有較高活性的抗癌藥物。順鉬（cisplatin)自從上世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)可以抑制 腫瘤細(xì)胞生長后，就廣泛應(yīng)用于癌癥化學(xué)治療。順鉬臨床應(yīng)用已經(jīng)超過30多年，與博來霉 素（bleomycin)、依托泊苷（etoposide)聯(lián)用治療睪丸癌效果顯著。第二代鉬類抗癌藥物卡 鉬（carboplatin)與順鉬結(jié)構(gòu)極其相似，其作用機(jī)理和耐藥方面也有共同點(diǎn)，兩者皆用于 治療卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、宮頸癌、淋巴癌等，但因?yàn)槎拘院湍退幮韵拗屏隧樸f、 卡鉬的使用范圍。奧沙利鉬（oxaliplatin)是第三代鉬類抗癌藥，其療效好、毒性小，而且 與順鉬、卡鉬無交叉耐藥，特別是在治療結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌方面均有較好的治療效果。
[0003] 鉬類抗癌藥物進(jìn)入細(xì)胞后，通過解離失去酸根負(fù)離子(如氯離子或者草酸根離 子)，同時(shí)結(jié)合兩分子的水，形成帶正電荷的水合鉬。帶正電荷的水合鉬可以跟細(xì)胞內(nèi)親質(zhì) 子的分子(包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)）結(jié)合。鉬原子選擇性地與DNA分子中的鳥嘌呤和腺嘌 呤上的N7原子結(jié)合，形成3種不同結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，即單加合物、鏈內(nèi)配對交聯(lián)、鏈間配對交 聯(lián)，但幾乎大部分結(jié)構(gòu)都是鏈內(nèi)配對交聯(lián)，即l，2-d(GpG)交聯(lián)。所有的交聯(lián)都會(huì)使DNA發(fā) 生扭轉(zhuǎn)，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)，阻礙DNA合成與復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。這類藥物耐 藥有多種因素參與，其中DNA切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)（NER)和堿基切除修復(fù)（BER)能力 加強(qiáng)，是鉬類化療耐藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制之一。
[0004] NER是DNA損傷修復(fù)的主要途徑，鉬類抗腫瘤藥物所致的DNA損傷，主要通過NER 通路進(jìn)行修復(fù)。NER過程中與鉬類耐藥有關(guān)的基因有ERCC1、ERCC2、ERCC5等，其中最關(guān)鍵基 因是ERCC1。ERCC1，即切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 l(ex_cision repair cross-completionl), 位于人類19號染色體上，參與DNA鏈的切割和損傷識(shí)別。
[0005] SNP的存在影響到不同個(gè)體ERCCl的表達(dá)?，F(xiàn)在研究較多的ERCCl的SNP是ERCCl 基因第118位密碼子上的一堿基由C到T的變異（又稱C118T點(diǎn)突變)。法國學(xué)者Viguier J對91名接受含鉬類化療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行ERCCl基因 Cl 18T點(diǎn)突變的多態(tài)性分 析，具有TT基因型的患者對含有鉬類藥物化療的敏感性明顯高于具有CT和CC基因型的患 者，而在接受不含鉬類藥物治療的患者中未發(fā)現(xiàn)ERCCl基因 C118T點(diǎn)突變的多態(tài)性對化療 敏感性有影響。Ryu等對109例接受以鉬類藥物為基礎(chǔ)化療NSCLC的患者進(jìn)行了 ERCCl基 因 C118T點(diǎn)突變的多態(tài)性分析，具有CC基因型患者中位生存時(shí)間與變異型CT或TT的中位 生存時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cox多因素模型分析ERCCl基因 C118T點(diǎn)突變的多態(tài)性與 化療敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果都提示：ERCCl基因 Cl 18T點(diǎn)突變的CC基因型患 者對鉬類藥物較其他兩種敏感，有較好的預(yù)后。
[0006] 參與BER的基因主要是X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 1，即XRCCl (X-ray repair cross complementary gene, XRCCl )。XRCCl通過與多聚二磷酸腺苷（ADP)核糖聚合酶、DNA連接 酶III及DNA多聚酶β作用修復(fù)包括順鉬在內(nèi)的各種理化因素引起的DNA損傷，對維持基因 組的穩(wěn)定十分重要。DNA修復(fù)能力和XRCCl基因表型的變化有關(guān)，由于存在單核苷酸多態(tài) 性（SNP)，不同個(gè)體的XRCCl活性不一樣，可能導(dǎo)致不同個(gè)體間修復(fù)能力的差異，從而影響 對鉬類藥物的敏感性。
[0007] XRCCl基因最常見的多態(tài)性是密碼子194的堿基突變(又稱R194W點(diǎn)突變)。袁苑 等研究發(fā)現(xiàn)，XRCCl基因的R194W點(diǎn)突變的多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)對鉬類藥 物敏感性有關(guān)。
[0008] 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs)是一組具有多種生理功能的同功酶家族。GST-π是 GSTs的一個(gè)亞型，主要功能為細(xì)胞解毒，它可催化親電物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合，其本身又可 與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合增加其水溶性、促進(jìn)其代謝及藥物排泄而降低抗癌藥的作用，另 外還可促進(jìn)DNA的修復(fù)，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。
[0009] GSTPl是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶超基因家族中π家族（GST-π)的成員之一，是腫瘤細(xì) 胞中表達(dá)量最為普遍、最常見的GSTs同工酶。Goekkua等發(fā)現(xiàn)，GSTPl基因的I105V點(diǎn)突 變的多態(tài)性對胃癌患者接受含順鉬藥物化療敏感性產(chǎn)生影響，Val/Val的患者化療有效率 (67%)明顯高于Ile/Ile和Ile/Val(21%)的患者，而Val/Val患者的中位生存時(shí)間（15 個(gè)月）也明顯高于Ile/Ile和Ile/Val (6個(gè)月）的患者。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種用于指導(dǎo)鉬類藥物用藥的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明保護(hù)一種引物組，由引物對甲、引物對乙和引物對丙組成；所述引物對甲由 序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述引 物對乙由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成； 所述引物對丙由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分 子組成。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備用于鑒定ERCCl基因的Cl 18T點(diǎn)突變、XRCCl基 因的R194W點(diǎn)突變和GSTPl基因的1105V點(diǎn)突變的試劑盒中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備用于指導(dǎo)鉬類藥物用藥的試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定ERCCl基因的C118T點(diǎn)突變、XRCCl基因的R194W點(diǎn) 突變和GSTPl基因的I105V點(diǎn)突變的試劑盒，包括所述引物組。所述試劑盒還可包括陽性 對照質(zhì)粒。所述陽性對照質(zhì)?？蔀閷⒕哂蠩RCCl基因的C118T點(diǎn)突變的DNA分子插入出 發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒甲、將具有XRCCl基因的R194W點(diǎn)突變的DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒得 到的重組質(zhì)粒乙和將具有GSTPl基因的I105V點(diǎn)突變的DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重 組質(zhì)粒丙。所述重組質(zhì)粒甲具體可為將序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子插入pMDlS-T 質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒乙 具體可為將序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子插入pMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI 和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒丙具體可為將序列表的序列9 所示的雙鏈DNA分子插入pMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間） 得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可包括陰性對照。所述陰性對照具體可為水，如去離子水。 所述試劑盒還可包括用于提取基因組DNA的試劑或試劑盒。所述試劑盒還可包括用于進(jìn)行 DNA測序的試劑、試劑盒或儀器。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)一種用于指導(dǎo)鉬類藥物用藥的試劑盒，包括所述引物組。所述試劑 盒還可包括陽性對照質(zhì)粒。所述陽性對照質(zhì)?？蔀閷⒕哂蠩RCCl基因的C118T點(diǎn)突變的 DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒甲、將具有XRCCl基因的R194W點(diǎn)突變的DNA分子插 入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒乙和將具有GSTPl基因的I105V點(diǎn)突變的DNA分子插入出發(fā)質(zhì) 粒得到的重組質(zhì)粒丙。所述重組質(zhì)粒甲具體可為將序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子插 入PMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述 重組質(zhì)粒乙具體可為將序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子插入pMDlS-T質(zhì)粒的多克隆位 點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒丙具體可為將序列 表的序列9所示的雙鏈DNA分子插入pMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SmaI和HindIII酶切 位點(diǎn)之間)得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可包括陰性對照。所述陰性對照具體可為水，如 去離子水。所述試劑盒還可包括用于提取基因組DNA的試劑或試劑盒。所述試劑盒還可包 括用于進(jìn)行DNA測序的試劑、試劑盒或儀器。
[0016] 以上任一所述的ERCCl基因的Cl 18T點(diǎn)突變的具體含義為：序列表的序列7所示 DNA分子自5'末端第438位核苷酸由C突變?yōu)門。以上任一所述的ERCCl基因的C118T點(diǎn) 突變的具體含義為：以人的基因組DNA為模板，采用所述引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物自5'末端第438位核苷酸由C突變?yōu)門。
[0017] 以上任一所述的XRCCl基因的R194W點(diǎn)突變的具體含義為：序列表的序列8所示 DNA分子自5'末端第58位核苷酸由C突變?yōu)門 (相應(yīng)的氨基酸由R突變?yōu)閃)。以上任一 所述的XRCCl基因的R194W點(diǎn)突變的具體含義為：以人的基因組DNA為模板，采用所述引物 對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端第58位核苷酸由C突變?yōu)門 (相應(yīng)的氨基酸由 R突變?yōu)閃)。
[0018] 以上任一所述的GSTPl基因的1105V點(diǎn)突變的具體含義為：序列表的序列9所示 DNA分子自5'末端第217位核苷酸由A突變?yōu)镚 (相應(yīng)的氨基酸由I突變?yōu)閂)。以上任一 所述的GSTPl基因的1105V點(diǎn)突變的具體含義為：以人的基因組DNA為模板，采用所述引物 對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端第217位核苷酸由A突變?yōu)镚 (相應(yīng)的氨基酸 由I突變?yōu)閂)。
[0019] 以人基因組DNA為模板，采用所述引物對甲、所述引物對乙或所述引物對丙進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，特異性良好，不會(huì)交叉擴(kuò)增人類基因組其他區(qū)域。
[0020] 所述鉬類藥物具體可為順鉬、卡鉬和奧沙利鉬中的至少一種。
[0021] 本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測與鉬類藥物敏感性相關(guān)的三個(gè)SNP位點(diǎn)，進(jìn)而可 以用于臨床指導(dǎo)鉬類藥物的個(gè)體化使用，提高臨床治療的針對性和可預(yù)見性。應(yīng)用本發(fā)明 提供的試劑盒進(jìn)行檢測，具有穩(wěn)定性高、操作簡便、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu) 點(diǎn)。本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，能夠滿足臨床檢驗(yàn)試劑工作的要求，利于實(shí)現(xiàn)安全合 理有效的鉬類藥物用藥個(gè)體化給藥。
【附圖說明】
[0022] 圖1為引物對甲的靈敏度檢測中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0023] 圖2為引物對乙的靈敏度檢測中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0024] 圖3為引物對丙的靈敏度檢測中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)