具有增加比例的e1b蛋白質的156r剪接同工型的溶瘤腺病毒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒及其在治療腫瘤性疾病中的用途。更特別地，本發(fā)明涉及 E1B基因的突變，所述突變調節(jié)該基因的剪接同工型的水平，從而改善溶瘤腺病毒的治療指 數(shù)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 溶瘤病毒
[0004] 溶瘤病毒療法為用于癌癥治療的新興的治療平臺。溶瘤病毒為在具有特異性致癌 表型的癌細胞中選擇性復制，從而殺死癌細胞同時避免殺死正常細胞的病毒。初步研宄集 中于天然存在的非致病性病毒，然而，這些研宄成果有限。雖然觀察到腫瘤生長減緩并且正 常組織未受損，但病程未發(fā)生改變。
[0005] 因此，最近的研宄已經集中于選擇性地靶向癌細胞的工程重組病毒。該類工程病 毒的一個實例為在病毒基因組的E1B區(qū)突變的腺病毒。
[0006]腺病毒的E1B和d53
[0007] 哺乳動物腫瘤抑制蛋白p53的一種功能為介導響應于DNA損傷或外源DNA合成的 細胞周期停滯和/或細胞凋亡。因此，一些病毒，諸如腺病毒，編碼在受感染細胞中使P53 失活的蛋白質以允許高效的病毒復制。這些蛋白質中的一種蛋白質，來自腺病毒的E1B區(qū) 的55千道爾頓蛋白質（E1B-55K或E1B-496R)，結合于p53,因此引起p53的大量喪失。這 從而防止P53-介導的受感染細胞的細胞凋亡。因此，E1B-496R對于在含有功能性p53的 細胞中的腺病毒的復制而言是必需的。
[0008] 人腫瘤細胞對于突變的（如置換、刪除、移碼突變）p53等位基因經常為純合或 雜合的，并缺乏對于正?？刂萍毎芷诒匦璧膒53功能（Hollstein等人（1991)Science 253:49;Levine等人（1991)Nature;351 (6326) :453-6)。因此，許多瘤細胞為p53H，因為 它們缺乏足夠水平的P53和/或因為它們表達突變形式的p53,所述突變形式不能夠發(fā)揮基 本的P53功能。
[0009]E1B突變的腺病毒
[0010] 利用瘤細胞與正常細胞之間的P53功能性差異已經對溶瘤腺病毒進行工程改造。 通過使E1B-496R蛋白質突變以除去與p53的結合相互作用或通過在E1B基因座內做出各 種刪除（參見，例如US5, 677, 178)，所得腺病毒可復制并最終裂解基本上缺乏p53功能的癌 細胞，但在具有正常P53功能的細胞中并不發(fā)生裂解。
[0011] 一個實例為0NYX-015 (最初命名為dl1520并且也稱為H101)，一種不表達 E1B-496R蛋白質的突變腺病毒（Heise等人（1997)Nat.Med. 3(6):639-645)。病毒在翻譯 起始密碼子之后立即含有終止密碼子并且也具有大量缺失的E1B-496R編碼序列。結果該 病毒缺乏結合P53并使p53失活的能力，因此僅可在p53功能缺陷的細胞（諸如瘤細胞和 腫瘤）中高效地復制。不幸的是，E1B-496R發(fā)揮除了結合p53并使p53失活以外的其它功 能（Eager等人（2001)CancerGeneTher. 18 (5): 305-317)。因此，0NYX-015 病毒在病毒晚 期mRNA的細胞質積聚、宿主細胞關閉以及晚期mRNA的翻譯中存在缺陷。因此，ONYX-015中 的突變降低突變病毒在腫瘤細胞中自身繁殖的能力。另外的問題為大量缺失使病毒基因組 不穩(wěn)定。
[0012] 另外的實例為0NYX-051和0NYX-053,它們?yōu)樵贓1B-496R蛋白質中含有點突變 (分別為R240A和H260A)而防止結合于p53的突變腺病毒。這些突變使病毒能夠在p53功能 有缺陷的細胞中選擇性復制，而不會降低病毒在這些細胞中復制的能力（Shen等人（2001) J.Virol. 75 (9) : 4297-4307 和US7, 785, 887)。
[0013] 然而，仍迫切需要改進的突變病毒，其溶瘤能力已經得到增強并且可用于癌癥的 治療。
[0014] 發(fā)明的公開內容
[0015] 本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)通過調節(jié)E1B基因表達的E1B基因產物的剪接同工型的水平和 類型，此類病毒的溶瘤活性可得到增強。因此，本發(fā)明的第一方面提供了重組腺病毒，在所 述重組腺病毒中E1B-156R同工型的比例相對于野生型水平有所增加，其中腺病毒在癌細 胞中具有溶瘤作用。重組腺病毒可以攜帶突變，如此E1B-156R同工型的比例相對于野生型 水平有所增加，使得腺病毒在癌細胞中具有溶瘤作用。突變可以在腺病毒的E1B基因的序 列中。因此，根據(jù)本發(fā)明的病毒在非瘤細胞中為復制受抑制的，但能夠在瘤細胞（包括基本 上缺乏功能性P53的瘤細胞）中表達復制表型。
[0016] 在本文描述的腺病毒的特異性實例中，E1B-156R的過表達被認為是由在腺病毒的 E1B基因中突變的93R剪接位點引起的失衡。156R能夠補足某些496R功能，但并非對腫瘤 選擇性（oncoselectivity)必需的功能。與現(xiàn)有技術相似類型的病毒相比，根據(jù)本發(fā)明的 病毒包括較好的體內功效的功能性E3B區(qū)。例如，Onyx-015缺乏E3B。事實上，Onyx-015病毒 及其選擇性在所有方面遠不如根據(jù)本發(fā)明的病毒。此外，發(fā)明人已經在正常細胞中測試根 據(jù)本發(fā)明制備的病毒，結果顯示病毒具有顯著的安全概況，特別是與已知的病毒Onyx-015 相比較。
[0017] 本文中，術語"復制受抑制的病毒"或"復制缺陷的"是指在轉化成癌癥狀態(tài)或瘤狀 態(tài)的預定的細胞群中優(yōu)先地抑制細胞增殖或誘導細胞凋亡的病毒。此類病毒在特征為非復 制的、非轉化的細胞的包含正常的P53功能水平的細胞中基本上不能抑制細胞增殖、誘導 細胞凋亡或表達復制表型。此類轉化細胞可以基本上缺乏P53功能，所述缺乏支持病毒復 制表型的表達。然而，根據(jù)本發(fā)明的病毒對瘤組織的選擇性可能比僅為P53狀態(tài)更廣泛；像 這樣的轉化狀態(tài)可能為選擇的基礎。例如，已經表明用0NYX-015病毒觀察到的溶瘤選擇性 可能是由于一些癌細胞系支持晚期病毒RNA從細胞核輸出的能力（在正常細胞中0NYX-015 由于E1B-496R缺失而喪失的功能）。相似的機制可以在本發(fā)明的重組腺病毒中操作，所述 重組腺病毒具有降低水平的E1B-496R蛋白質。本發(fā)明的重組腺病毒中E1B-156R水平的增 加如何導致溶瘤選擇性還未完全清楚。
[0018] 通常，根據(jù)本發(fā)明的復制受抑制的病毒在包含正常的p53功能的細胞上的噬斑 效率顯示出顯著減少（針對合適的測定，參見Wang，Y.，G.Hallden等人（2003).〃E3gene manipulationsaffectoncolyticadenovirusactivityinimmunocompetenttumor models."Naturebiotechnology21 (11): 1328-1335) ^ 可以使用的合適測定的另一實例為 使用例如四唑鑰染料諸如MTT、XTT、MTS或WST進行細胞毒性測定以測量活細胞的喪失（參 見Berridge等人，Biotechnology Annual Review, 11:127-152 (2005)。
[0019] 如本文所用，術語"復制表型"是指被病毒諸如復制受抑制的腺病毒感染的細胞的 以下表型特征中的一種或多種：（1)晚期基因產物，諸如衣殼蛋白（如，腺病毒的五鄰體基 質多肽）或由病毒晚期基因啟動子起始的RNA轉錄物的顯著表達；（2)病毒基因組的復制 或復制中間體的形成；（3)病毒衣殼或包裝的病毒體顆粒的裝配；(4)在受感染細胞中細胞 病變效應（CPE)的出現(xiàn)；（5)病毒裂解周期的完成；以及（6)其它表型改變，在感染有編碼 功能性癌蛋白的野生型復制-感受態(tài)DNA病毒的非瘤細胞中p53功能喪失后，所述表型改 變通常為偶然的。根據(jù)本發(fā)明的復制表型包括至少一種上文列出的表型特征，優(yōu)選多于一 種表型特征，諸如2、3、4、5、6或更多種特征。
[0020] 測量這些表型的技術對本領域技術人員將為已知的。例如，評價CPE出現(xiàn)的方法 在本文的實施例中進行了描述并使用50%的組織培養(yǎng)感染劑量（TCIDJ以及噬斑形成單 位（pfu) /細胞的數(shù)目（在感染日的細胞計數(shù)）進行評估。
[0021] 術語"瘤細胞"是指顯示出相對自發(fā)性生長，使得它們顯示出特征為細胞增殖顯著 失控的異常生長表型的細胞。瘤細胞包括可以活性復制或處于暫時非復制休止態(tài)（G1或 G0)的細胞；相似地，瘤細胞可以包括具有分化良好表型的細胞、低分化表型的細胞或兩種 類型的細胞的混合物。因此，并非所有瘤細胞在給定的時間點處必定復制細胞。于此定義 為瘤細胞的細胞組由在良性腫瘤中的細胞以及在惡性（或浸潤性（frank))腫瘤中的細胞 組成。浸潤性瘤細胞經常被稱為癌癥，如果源于內胚層的或外胚層的組織學起源的細胞，則 通常為癌，或如果源于衍生自中胚層的細胞類型，則通常為肉瘤。術語瘤細胞和癌細胞在本 文中可互換地使用。
[0022] 于此，術語"p53功能"是指具有基本上正常水平的由p53基因編碼的多肽的性 質（即，相對于相同組織學類型的非瘤細胞），其中P53多肽能夠結合于野生型腺病毒 E1B-49