鵝t淋巴細胞表面分子cd4的檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及鵝T淋巴細胞表面分子⑶4的檢測方法及 試劑盒。
【背景技術】
[0002] T淋巴細胞是宿主細胞免疫系統(tǒng)中最重要的免疫活性細胞之一，除直接介導細胞 免疫功能外，還對機體免疫應答的調節(jié)起關鍵作用。未成熟T細胞前體到成熟T細胞的分 化依賴于T細胞表面受體的信號傳導，反映在胸腺細胞表面不同程度的表達CD4和CD8表 面共受體分子。最終，能在外來抗原入侵機體時被激活為效應細胞從而發(fā)揮細胞免疫效應 的成熟T淋巴細胞是CD4或者CD8單陽性的效應淋巴細胞。CD4分子是一種單鏈跨膜糖蛋 白，包含有一個疏水跨膜區(qū)，一個較長的胞漿區(qū)和一個胞外區(qū)，該胞外區(qū)含有4個類免疫球 蛋白的功能區(qū)。在免疫應答中，CD4分子對MHC II類分子有特異的親和力，能與MHC II類 分子結合，從而增強T淋巴細胞與靶細胞的結合。因此，在生產實際中檢測CD4分子即代表 檢測到⑶4+T淋巴細胞。
[0003] 免疫學方法檢測抗體最常見的檢測模式是間接酶聯(lián)免疫分析（ELISA)。ELISA的 基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍 保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本 與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物 與液體中的其他物質分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應也結合在固相載體上。加 入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相 關，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結 果，使測定方法達到很高的敏感度。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢 測迅速和非放射性以及可以批量測定等諸多優(yōu)點，使得ELISA方法得到了越來越廣泛的應 用。
[0004] 監(jiān)控T細胞的數(shù)量，對于商品化疫苗免疫前后宿主免疫狀態(tài)的監(jiān)控，對于了解機 體的免役狀態(tài)，對于宿主感染疾病進程的監(jiān)控，及對于確定抗感染治療及機會性感染預防 性治療方案，評估藥物療效等方面均具有十分重要的意義。到目前為止，國內外已有人、 鼠、豬、牛、羊、雞、鴨等種屬的T細胞表面CD4雙抗體夾心ELISA試劑盒的商品化供應。然 而，有關鵝T細胞免疫的研宄較少且相對滯后。目前，僅美國MyBioSource公司出售的Goose sCD4(SCD4)ELISA Kit(Cat. N〇:MBS020139)，說明書指出用于檢測鵝可溶性CD4的水平。并 且，值得注意的是，該試劑盒是使用鼠抗人sCD4單克隆抗體為一抗，進行樣品的檢測。由于 生物物種遺傳進化的遠近，物種之間序列存在不同的差異。據(jù)我們前期研宄數(shù)據(jù)顯示鵝CD4 氨基酸與人CD4氨基酸的序列一致性僅26%?；谏鲜龅臄?shù)據(jù)，我們推測該試劑盒并不能 有效、全面、準確的檢測鶴體CD4水平。而且，迄今為止，尚未見有可使用抗鶴CD4抗體為一 抗的鵝T細胞表面CD4雙抗體夾心ELISA試劑盒的商品化產品。

【發(fā)明內容】

[0005] 有鑒于此，首先，本發(fā)明提供了一種鵝CD4多克隆抗體，該鵝CD4多克隆抗體是以 鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫動物而得到，特異性強；鵝CD4多克隆抗體可用于定性或 定量檢測鵝T淋巴細胞表面分子CD4,也可用于制備定性或定量檢測鵝T淋巴細胞表面分 子CD4試劑盒；其次，本發(fā)明提供了 一種鵝T淋巴細胞表面分子CD4雙抗體夾心ELISA檢 測試劑盒，該試劑盒易于推廣應用，適合臨床與生產實踐上大批量地檢測樣品；第三，本發(fā) 明提供了一種鵝T淋巴細胞表面分子CD4雙抗體夾心ELISA檢測方法，該檢測方法是基于 上述的鵝CD4多克隆抗體進行檢測的，其靈敏性高、特異性強、重復性好、省時省力、操作簡 便；第四，本發(fā)明還提供了一種鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的制備方法，該方法是通過構建原核 表達重組質粒在原核生物中大量表達鵝⑶4胞外區(qū)重組蛋白。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：
[0007] 鵝CD4多克隆抗體，以鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫動物，得到鵝CD4多克隆 抗體；所述鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示，該鵝CD4多克隆抗體是以鵝 CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫動物而得到，特異性強。
[0008] 鵝⑶4多克隆抗體可用于定性或定量檢測鵝T淋巴細胞表面分子⑶4,也可用于制 備定性或定量檢測鵝T淋巴細胞表面分子CD4試劑盒。
[0009] 本發(fā)明所述的一種鵝T淋巴細胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，所 述試劑盒至少包括所述雙抗體，所述雙抗體中至少一種抗體采用權利要求1所述的鵝CD4 多克隆抗體。
[0010] 進一步，所述的一種鵝T淋巴細胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，所 述雙抗體均采用權利要求1所述的鵝CD4多克隆抗體。
[0011] 進一步，所述的一種鵝T淋巴細胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，所 述雙抗體包括鼠抗鵝CD4多克隆抗體和兔抗鵝CD4多克隆抗體，所述鼠抗鵝CD4多克隆抗 體為捕獲抗體，所述兔抗鵝CD4多克隆抗體為檢測抗體；所述鼠抗鵝CD4多克隆抗體是以鵝 CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫鼠，得到鼠抗鵝CD4多克隆抗體；所述兔抗鵝CD4多克隆抗 體是以鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫兔子，得到兔抗鵝CD4多克隆抗體；所述鵝CD4胞 外區(qū)重組蛋白的序列如SEQ ID NO :3所示。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒檢測靈敏性高、特異性強、重復性好，易于推廣應用，適合臨床與 生產實踐上大批量地檢測樣品。
[0013] 本發(fā)明所述的一種鵝T淋巴細胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測方法，所述 雙抗體包括鼠抗鵝CD4多克隆抗體和兔抗鵝CD4多克隆抗體，具體包括如下進行的步驟：
[0014] 1)鼠抗鵝CD4多克隆抗體和兔抗鵝CD4多克隆抗體的制備
[0015] 以鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白為抗原免疫鼠，得到鼠抗鵝CD4多克隆抗體；以鵝CD4胞 外區(qū)重組蛋白為抗原免疫兔子，得到兔抗鵝CD4多克隆抗體；所述鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的 序列如SEQ ID NO :3所示。
[0016] 2)鵝T淋巴細胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA定量檢測
[0017] 以步驟1)所得到的鼠抗鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體為捕獲抗體，所得到的兔抗 鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體為檢測第一抗體，以HRP-羊抗兔IgG為檢測第二抗體，以鵝 CD4蛋白標準品，進行ELISA分析，制備標準曲線；然后取待測樣品，以步驟1)所得到的鼠 抗鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體為捕獲抗體，所得到的兔抗鵝CD4重組蛋白的多克隆抗體 為檢測第一抗體，以HRP-羊抗兔IgG為檢測第二抗體，進行ELISA分析，判斷待測樣品中是 否含有鵝T淋巴細胞表面分子CD4,然后根據(jù)所制備標準曲線計算待測樣品中所含鵝T淋巴 細胞表面分子CD4的含量。本發(fā)明中應用雙抗體夾心法測定待測樣品中可溶性淋巴細胞表 面蛋白CD4水平，基本原理為：用純化的捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被捕獲 抗體的微孔中依次加入待測樣品，再加入檢測第一抗體，然后與HRP標記的檢測第二抗體 結合，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用 下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的可溶性抗原呈正相關。用酶標儀在450nm波 長下測定吸光度（0D450數(shù)值），通過標準曲線計算樣品中可溶性抗原濃度。本發(fā)明的鵝T 淋巴細胞表面分子CD4雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，其靈敏性高、特異性強、重復性好、 省時省力、操作簡便。
[0018] 進一步，優(yōu)選的，以HRP-羊抗兔IgG為檢測第二抗體。
[0019] 進一步，所述的一種鵝T淋巴細胞表面分子⑶4雙抗體夾心ELISA檢測方法，所述 ELISA分析的具體方法為：將所述捕獲抗體包被于酶標板孔中，于4°C孵育過夜，次日采用 PBST充分洗板，然后采用含有BSA的PBS封閉，PBST充分洗滌后，每孔中加入鵝CD4蛋白 標準品或待測樣品進行反應，采用PBST洗板后，每孔中加入檢測第一抗體進行孵育，采用 PBST洗板，然后每孔中加入檢測第二抗體進行孵育，采用PBST洗板，每孔加入TMBM2O2底 物溶液進行顯色反應，最后以〇. 25 %氫氟酸終止液終止顯色反應，讀取波長450nm光密度 值即0D450nm值。
[0020] 本發(fā)明所述的鵝CD4胞外區(qū)重組蛋白的制備方