一種稻瘟病菌菌種的長期保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物學(xué)和植物保護(hù)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種稻瘟病菌菌種的長期 保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由稻瘟病菌grisea Barr.引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一， 每年由其造成的水稻損失可占水稻總產(chǎn)量的10%_30%，是阻礙水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因素之 一。而根據(jù)發(fā)病時期和稻瘟病菌侵染水稻的部位，可將水稻稻瘟病分為苗瘟、葉瘟、穗頸瘟 和谷粒瘟，其中以穗頸瘟對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)造成的影響最為嚴(yán)重。種植抗病品種是防治稻 瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，而抗病水稻品種單一大面積推廣種植3-5年后容易喪失抗病性， 造成稻瘟病的爆發(fā)流行。一般認(rèn)為抗病品種抗性的喪失主要原因是由于稻瘟病菌群體復(fù) 雜、易變異，其生理小種發(fā)生變化常導(dǎo)致新的生理小種的出現(xiàn)和積累。因此，鑒定和監(jiān)測稻 瘟病菌群體生理小種組成類型和變化動態(tài)對抗病育種、主栽品種推廣布局和抗病性變化都 有重要的意義，而稻瘟病菌保存是完成這一科研工作的基礎(chǔ)。
[0003] 真菌菌種常用的保存方法有菌種定期移植培養(yǎng)保存法、礦物油保存法、冷凍干燥 保存法。其中，菌種定期移植保存法是將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌種長滿 斜面后，棉塞部分用滅菌報紙包好，置于4°C冰箱中保存，其優(yōu)點是操作簡單，使用方便，能 避免螨類為害，并能隨時檢查保存菌種是否感染雜菌；但其缺點是菌種的生長和代謝并未 完全被抑制，菌種容易變異，且培養(yǎng)基成分會逐漸被菌種消耗，每隔6-8個月需要移植轉(zhuǎn)代 一次，同時存在需要較大的存儲空間、玻璃器皿容易破裂等問題。礦物油保存法是在生長好 的菌種斜面上加一層滅菌的石蠟油，石蠟油的量超過菌種斜面頂部lcm，可以置于室溫或冰 箱保存，其優(yōu)點是不需要特殊設(shè)備，菌種存活期較長，菌種在礦物油下生長雖然沒有停止， 但受到明顯抑制，培養(yǎng)基不容易干燥，無需經(jīng)常移植，不易受到螨類為害；其缺點是需要的 存儲空間大，玻璃器皿容易破裂，同時由于菌絲體外有礦物油，菌種恢復(fù)時生長緩慢且外觀 帶有粘性，使恢復(fù)菌種較為繁瑣，一般需要再移植1-2次才能得到良好的菌種。冷凍干燥保 存法是將菌種孢子懸浮在保護(hù)劑中，再把小量孢子懸浮液在無菌條件下分盛在滅菌的安瓿 中，然后接上干燥器和抽氣系統(tǒng)，將安瓿放在干冰和乙酸乙酯的混合冷凍液中，抽氣使懸浮 液完全干燥，安瓿封口后置于室溫或冰箱中保存，其優(yōu)點是保存時間長，菌種不易變異；其 缺點是該方法不適用于不產(chǎn)生孢子只有菌絲體類型的真菌保存，且需要專門設(shè)備，費用較 尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種稻瘟病菌菌種的長期保存方法，其操作 簡單，不需要專門的設(shè)備，且保存的稻瘟病菌菌種性狀穩(wěn)定、不易變異、不需定期移植，并能 節(jié)約存儲空間，避免螨類為害和菌種污染，對提高菌種保存的效率和質(zhì)量有顯著效果。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種稻瘟病菌菌種的長期保存方法，是用稻桿作為稻瘟病菌的保存載體對稻瘟病菌進(jìn) 行保存；其具體包括如下步驟： 步驟1 :將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿平板中，待培養(yǎng)基凝固后快速將剪切好的稻桿均勻放置 于培養(yǎng)基上； 所述培養(yǎng)基為可溶性淀粉培養(yǎng)基，其成分為：可溶性淀粉10. 〇g，酵母膏2. Og，CaCO3 3. 0g，瓊脂粉 16. 0g，蒸餾水 1000. 0ml，ρΗ6· 5 ; 步驟2 :用接種針挑取一塊待保存的稻瘟病菌菌塊，將其置于培養(yǎng)基中心無稻桿處，使 其菌絲面向下； 步驟3 :將培養(yǎng)皿平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中，25°C恒溫培養(yǎng)至菌種長滿培養(yǎng)皿； 步驟4 :用鑷子將稻桿夾出放置于紙袋中； 步驟5 :用透明膠帶將紙袋封口； 步驟6 :在紙袋上標(biāo)注菌種信息及保存日期； 步驟7 :將紙袋置于烘箱中，30°C恒溫烘干48h ; 步驟8:將烘干后的紙袋裝入收納盒，用透明膠帶封口，并標(biāo)注菌種信息，再將收納盒 置于-80°C至4°C保存。
[0006] 步驟1所用培養(yǎng)皿平板的直徑為90mm ;所述剪切好的稻桿長20mm ; 步驟2所取稻瘟病菌菌塊的直徑為5mm ; 步驟4所用紙袋的規(guī)格為138mm X 67mm ; 步驟5紙袋封口所用透明膠帶的寬為20mm ; 步驟8收納盒封口所用透明膠帶的寬為50mm。
[0007] 上述步驟中，步驟1、步驟2、步驟4和步驟5均須在無菌操作臺上進(jìn)行無菌操作， 且操作中所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、稻桿、接種針、鑷子、紙袋均需預(yù)先在121°C條件下滅菌處理 25min〇
[0008] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于： (1) 水稻是稻瘟病菌的天然寄主，本發(fā)明以稻桿為保存載體對稻瘟病菌進(jìn)行保存，不僅 可為稻瘟病菌的生長提供最適宜的載體，且在操作過程中，稻桿會吸取培養(yǎng)基凝固后的冷 卻水及培養(yǎng)基中少量營養(yǎng)物質(zhì)，從而為稻瘟病菌提供生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，又可避免營養(yǎng) 過于優(yōu)裕引起的稻瘟病菌菌種退化，使保存的稻瘟病菌菌種生長良好，且性狀穩(wěn)定； (2) 本發(fā)明保存方法操作方便快速，且一個培養(yǎng)皿可以放置約30根稻桿，有利于實現(xiàn) 稻瘟病菌的快速、大批量保存； (3) 按本發(fā)明進(jìn)行保存，可使菌種保存周期延長，且保存周期內(nèi)不用定期移植，節(jié)省了 保存成本； (4) 該保存方法不僅節(jié)省了保存空間，還便于菌種查找，且避免了使用玻璃器皿易碎易 破的缺點，安全可靠； (5) 按本發(fā)明保存的菌種活化方便，即將透明膠帶撕開，夾出稻桿放在培養(yǎng)基上就可以 進(jìn)行活化培養(yǎng)，而將紙袋再次封口放入冰箱仍可繼續(xù)保存，同時可將一個菌種再分裝多個 紙袋，每次使用一個紙袋，可有效避免多次活化菌種造成的污染。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明移入菌種待保存的培養(yǎng)示意圖，其中，1-稻桿，2-培養(yǎng)基，3-稻瘟病 囷囷塊。
【具體實施方式】
[0010] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0011] 操作中所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、稻桿、接種針、鑷子、紙袋均預(yù)先在121°C條件下滅菌 處理25min ;且所述步驟中步驟1、步驟2、步驟4和步驟5均須在無菌操作臺上進(jìn)行無菌操 作。
[0012] 實施例1 一種稻瘟病菌菌種的長期保存方法，具體包括如下步驟： 步驟1 :在超凈工作臺上將滅菌的可溶性淀粉培養(yǎng)基倒入滅菌的直徑為90mm的培養(yǎng)皿 平板中，待培養(yǎng)基凝固后快速將剪切好的、長為20mm的滅菌稻桿均勻放置于培養(yǎng)基上