一株防治地黃根腐病的拮抗菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株細菌菌株，特別涉及一株防治地黃根腐病的拮抗細菌，可用于克服或緩解連作地黃土傳病害問題，屬于微生物和生物防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]對于連作障礙問題的認識由來已久，很多的糧食作物(如小麥、馬鈴薯)、經(jīng)濟作物(如煙草、棉花)、油料作物(如大豆、花生)、蔬菜(黃瓜、番茄)、園藝作物(如西瓜、草莓)、藥用植物(如人參、地黃、三七)以及人工林(如楊樹、杉木)都存在不同程度的連作障礙問題。但是，長期困擾我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的連作障礙問題，在中藥材栽培生產(chǎn)中表現(xiàn)尤為嚴(yán)重，約70%的塊根類藥用植物都存在不同程度的連作障礙問題，如地黃、三七、當(dāng)歸、人參等藥用植物均存在嚴(yán)重的連作障礙問題。
[0003]塊歲{Rehmannia glutinosa L.)為玄參科多年生草本植物，以塊根入藥，其用藥歷史悠久、臨床療效顯著，是我國著名的道地藥材。然而，地黃的連作障礙問題尤為嚴(yán)重，連作下地黃植株往往表現(xiàn)出生長發(fā)育不良的癥狀:地上部植株矮小弱化、葉片光合作用減弱、易枯萎倒伏；地下部塊根無法正常膨大、根冠比失調(diào)；生育期縮短，藥效成分無法有效積累，藥用品質(zhì)下降；病蟲害發(fā)生猖獗，塊根易腐爛，常發(fā)生大面積枯死現(xiàn)象(如圖1所示)。通常，每茬地黃收獲后須間隔8?10年方可在同一地塊上再次種植。地黃連作不僅造成產(chǎn)量、品質(zhì)急劇下降以及土傳病害嚴(yán)重，更加令人擔(dān)憂的是，在連作障礙成因及作用機理尚不明確的情況下，大部分農(nóng)戶試圖通過增施肥料、濫用農(nóng)藥等措施來維持產(chǎn)量，可是效果往往不佳，不但提高了生產(chǎn)投入，還導(dǎo)致環(huán)境污染、中藥材農(nóng)殘超標(biāo)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能退化等一系列問題，使中藥資源的栽培生產(chǎn)陷入了惡性循環(huán)。因此，構(gòu)建一種合理有效的措施用于克服或緩解連作障礙和土傳病害問題成為藥用植物資源生態(tài)學(xué)研宄的重要內(nèi)容。課題組前期研宄發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌(如圖2所示)是導(dǎo)致地黃連作障礙、土傳病害猖獗的重要因素，其含量隨地黃連作年限增加而不斷增加。而利用拮抗菌進行植物病害的生物防治被認為是一種科學(xué)、合理、高效、環(huán)境友好型的措施。本發(fā)明針對地黃?；图怄哏牭毒蛛x篩選到一株高效措抗該病原真菌的措抗細菌，鑒定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudotnoimsaeruginosa LK-120

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株防治地黃根腐病的拮抗細菌，用于生物防治地黃連續(xù)種植過程中常見的根腐病問題，為克服或緩解地黃連作障礙問題提供生防菌株。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明所提供的措抗細菌為銅綠假單胞菌{Pseudomorms aeruginosa LK-12)，該菌株已于2015年6月9日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院的中國科學(xué)院微生物研宄所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 10966。
[0006]本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌aeruginosa LK-12)對地黃?；筒≡患怄哏牭毒哂泻軓姷霓卓棺饔?。
[0007]本發(fā)明所述的有益拮抗菌具有以下幾個優(yōu)點:
(I)本發(fā)明所述的措抗菌一銅綠假單胞菌aeruginosa LK-12)是通過大量的篩選工作篩選到的，是從2946株土壤細菌中篩選得到的，對地黃?；图怄哏牭毒哂泻軓姷霓卓剐Ч?。
[0008](2)本發(fā)明所述的措抗菌一銅綠假單胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)對篩選于地黃病變根部的黃曲霉和篩選于藥用植物太子參連作土壤或病變部位的尖孢鐮刀菌、裸節(jié)霉菌、串珠霉菌也具有很強的拮抗作用。
[0009](3)本發(fā)明所述的措抗菌一銅綠假單胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)來源于連作地黃根際土壤中，并非源自其他生境，根際定殖效果較好并且安全可靠，對地黃及其他常種作物(如小麥、玉米、水稻、大豆、花生等)均無致病侵染能力。
[0010](4)本發(fā)明所述的措抗菌一銅綠假單胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)的培養(yǎng)溫度范圍優(yōu)選為25° C?45° C，pH范圍為5?9.5，適合生長的溫度和pH范圍較廣，適應(yīng)性強。
【附圖說明】
[0011]圖1為不同連作年限的地黃地上部和地下部生長情況。
[0012]圖2為地黃植株病害根部分離到的病原菌一尖孢鐮刀菌的菌落形態(tài).A:表示菌落正面:表示菌落反面。
[0013]圖3為措抗菌銅綠假單胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)的革蘭氏染色及顯微形態(tài)觀察。
[0014]圖4為銅綠假單胞菌(/kewt/offlmas aeruginosa LK-12)與病原真菌的對峙培養(yǎng)照片.平板中心接種各類病原真菌，其中A:尖孢鐮刀菌(來源地黃);B:黃曲霉(來源地黃)；C:尖孢鐮刀菌(來源太子參);D:踝節(jié)霉菌(來源太子參);E:串珠鐮刀菌(來源太子參).B為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)平板，其余均為馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基。
[0015]圖5為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa LK-12)的代謝產(chǎn)物抑制尖孢鐮刀菌生長.A:添加LK-12發(fā)酵液；B:未添加LK-12發(fā)酵液。
[0016]圖6為銅綠假單胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)防控尖孢鐮刀菌侵染地黃組培苗.A:表示僅接種尖孢鐮刀菌(左)及接種尖孢鐮刀菌和假單胞菌(右)的組培苗生長情況俯視圖:表示僅接種尖孢鐮刀菌(左)及接種尖孢鐮刀菌和假單胞菌(右)的組培苗生長情況側(cè)面圖。
[0017]圖7為銅綠假單胞菌(Aewt/offlmas aeruginosa LK-12)防控尖孢鐮刀菌侵染地黃脫毒移栽苗.左三盆表示僅接種尖孢鐮刀菌；右三盆表示接種假單胞菌(距根部2 cm接種一圈)和尖孢鐮刀菌(距根部4 cm接種一圈)。
【具體實施方式】
[0018]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細的描述。以下實施例僅僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
[0019]實施例1措抗菌銅綠假單胞菌(AeWtZofflmas aeruginosa LK-12)的篩選及其鑒定
1、地黃?；图怄哏牭毒肟咕鶳seudomonasaeruginosa LK-12的篩選
本發(fā)明所述的措抗菌銅綠假單胞菌aeruginosa LK-12)從連作地黃根際土壤中篩選得到。
[0020]1.1假單胞菌選擇性培養(yǎng)基配制
假單胞菌選擇性培養(yǎng)基(pseudomonas selective isolat1n agar，PSIA)配制方法如下:稱取20 g大豆-酪蛋白消化物瓊脂培養(yǎng)基(soybean casein digest agar，SO)) (BD,USA)，加495.5 mL雙蒸水加熱攪拌，充分溶解后，再加入I mL 0.l%(wt/vol)結(jié)晶紫儲備液，121° C高溫高壓滅菌15 min，冷卻至大約50° C時，往培養(yǎng)基中再添加3.5 mL 5% (wt/vol)呋喃咀啶儲備液，充分混勻后，迅速倒板，冷卻凝固后即制得假單胞菌選擇性培養(yǎng)基平板。
[0021]其中，0.1% (wt/vol)結(jié)晶紫儲備液的配制方法為:稱取0.1 g結(jié)晶紫(Sangon，上海)，溶于100 mL雙蒸水中，室溫保存?zhèn)溆?；呋喃咀啶儲備液的配制方法?稱取5 g呋喃妥因(Sangon，上海)，加入到90 mL N, N-二甲基甲酰胺(Sangon，上海)中充分溶解，再定容至100 mL，室溫避光保存?zhèn)溆谩?br>[0022]1.2根際土壤中假單胞菌分離篩選
稱取5 g的新鮮根際土壤，溶于45 mL冷卻的無菌水中，充分振蕩搖勾，得KT1稀釋液，取5 mL KT1稀釋度的土壤懸浮液至另一瓶45 mL冷卻的無菌水中，充分振蕩搖勾，得10 _2稀釋液，再次稀釋得10_3稀釋液，吸取60 μ L的土壤稀釋液，均勻涂布到制好的假單胞菌選擇性培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度均涂3個平板，置于32° C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 h。挑選單菌落清晰可辨且生長均勻的平板，轉(zhuǎn)接至新的選擇性培養(yǎng)基平板上32° C繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落清晰可見時，置于4° C冰箱中短暫保存?zhèn)溆谩?br>[0023]1.3地黃?；图怄哏牭毒霓卓咕Y選
配制馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，配制如下:稱取洗凈去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊，加適量水煮沸后計時25 min，用四層紗布過濾，往濾液中加入鹿糖30 g (或葡萄糖30 g)、瓊脂15 g，繼續(xù)加熱攪拌混勾，稍加冷卻后再加水定容至1000mL,分裝，高壓滅菌后倒板或保存?zhèn)溆谩?br>[0024]經(jīng)121° C高溫高壓滅菌的PSA或PDA培養(yǎng)基，迅速倒板，冷卻凝固后制得平板，在培養(yǎng)皿底部過圓心畫十字架，在距離圓心2.5