一種蝦青素酯酶生產菌株及其在游離蝦青素制備中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能微生物篩選技術領域，具體涉及一種蝦青素酯酶生產菌株及其在 游離蝦青素制備中的應用。
【背景技術】
[0002] 蝦青素（Astaxanthin，又稱3, 3' -二羥基-4, 4' -二酮基-β，β -胡蘿卜素）是 萜烯類不飽和化合物，是類胡蘿卜素的一種，廣泛存在于生物體內，特別是蝦、蟹、藻類和魚 類等水生生物。蝦青素為紫紅色，易氧化，氧化后為蝦紅素（Astacene)。蝦青素不溶于水， 具有脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳。
[0003] 大量研宄發(fā)現，蝦青素具有良好的生物學功能，如抗衰老、抗氧化、增強機體免疫 力、抗腫瘤等。蝦青素獨特的分子結構，使其成為自然界最強的抗氧化劑，其抗氧化能力是 其他類胡蘿卜素的10倍，維生素 E的500倍，被譽為"超級抗氧化劑"或"超級維生素 Ε"。 目前，蝦青素已憑借其良好的生物學功能，成為眾多行業(yè)的"寵兒"，比如食品、水產養(yǎng)殖、醫(yī) 藥及化妝品等行業(yè)。
[0004] 目前，蝦青素的生產主要分為兩類，一類是化學合成法，另一類是生物法。與生物 法相比，化學合成法不僅工藝過程繁瑣復雜，而且合成過程中可能被其它有害物質污染，產 品中還含有非天然的異構體，影響其安全性。不僅如此，化學合成的蝦青素在結構、生理功 能、應用等方面與天然蝦青素有著很大的區(qū)別，使得化學合成蝦青素的應用受到進一步的 限制。在結構方面，化學合成的蝦青素主要為順式結構，而天然蝦青素主要為反式結構。目 前，世界各國越來越重視對化學合成蝦青素的管理，其中美國食品與藥物管理局（FDA)已 明確禁止化學合成的蝦青素進入保健食品市場，僅允許反式結構的蝦青素作為水產養(yǎng)殖的 添加劑。因此，生物法將取代化學合成法，成為生產蝦青素的主要方法。
[0005] 在生物法制備過程中，主要是從水生動物（如蝦及蟹）的殼內以及培養(yǎng)的雨生紅 球藻中提取蝦青素。水生動物和雨生紅球藻中的蝦青素多以蝦青素酯的形式存在，通過將 蝦青素酯水解可獲得游離蝦青素。目前水解蝦青素酯主要采用皂化的方法，該方法雖然具 有反應迅速的優(yōu)點，但反應過程過于劇烈，難以對產物進行控制，高濃度的堿也會對蝦青素 造成破壞，產生較多的副產物，如產生蝦紅素和半蝦紅素等。不僅如此，反應過程采用大量 的堿和有機溶劑，不僅破壞了環(huán)境，而且造成了極大的浪費，不符合國家發(fā)展的戰(zhàn)略。另外 一種是采用脂肪酶酶解的方法，通過使用脂肪酶降解蝦青素酯來制備游離蝦青素，這為游 離蝦青素的生產提供了一條新的思路，但酶解過程復雜，需預先水解甘油三酯，并移除游離 脂肪酸后，再利用脂肪酶水解蝦青素酯，耗時長、成本高。而且由于蝦青素酯的水不溶性和 成分復雜等特點，導致脂肪酶酶解效率較低，使其在大規(guī)模制備過程中會受到限制。利用發(fā) 酵法制備游離蝦青素被認為是一個有效的方法，但目前存在的混菌發(fā)酵法并不能實現蝦青 素酯的完全水解，游離蝦青素生產的工業(yè)化進程依舊無法實現。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種蝦青素酯酶生產菌株及其在游離蝦青素制備中的應用， 即一種能高效降解蝦青素酯的菌株，及該菌株在生產游離蝦青素中的應用，從而彌補現有 技術的不足。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp. )OUC-LH15,該菌株于 2015年03月30日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研宄 所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏編號為 CGMCC NO. 10672。
[0008] 上述的寡養(yǎng)單胞菌用于發(fā)酵生產游離蝦青素；
[0009] 本發(fā)明還提供一種生產游離蝦青素的方法，是在添加有蝦青素酯或提供蝦青素酯 的原料的培養(yǎng)基中接種寡養(yǎng)單胞菌來發(fā)酵制備游離蝦青素。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的含有蝦青素酯的原料為雨生紅球藻油和/或含有蝦青素酯的水 生動物（如蝦及蟹）的有機溶劑提取物。
[0011] 作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下（g/mL質量體積比）：雨生紅球藻油和/或含有 蝦青素酯的水生動物（如蝦及蟹）有機溶劑提取物、KH 2PO4 0· 025%、MgS04 ·7Η20 0· 025%、 FeSO4 · 7Η20 0· 001%、牛肉膏 0· 1%、蛋白胨 1%、ρΗ 7· 0，
[0012] 上述的培養(yǎng)基中優(yōu)選添加 Tween-80,其添加量依據實施過程的發(fā)酵優(yōu)化結果來 定；
[0013] 本發(fā)明提供了一株高效利用雨生紅藻油和/或水生動物（如蝦及蟹）有機溶劑 提取物生產游離蝦青素的寡養(yǎng)單胞菌菌株，該菌株能夠高效的降解蝦青素酯制備游離蝦青 素。而且，本發(fā)明通過實驗，確定發(fā)酵液中吐溫80添加量、接種量、發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時間 條件，從而提供了一種高效的制備游離蝦青素的方法。
【附圖說明】
[0014] 圖I :Tween-80添加量對發(fā)酵的影響圖；
[0015] 圖2 :種齡對發(fā)酵的影響圖；
[0016] 圖3 :接種量對發(fā)酵的影響；
[0017] 圖4 :發(fā)酵液初始pH對發(fā)酵的影響；
[0018] 圖5 :菌株發(fā)酵曲線圖；
[0019] 圖6 :本發(fā)明微生物發(fā)酵法制備的游離蝦青素 HPLC圖譜
[0020] 圖7 :皂化法制備的游離蝦青素的HPLC圖譜
[0021] 圖8 :雨生紅球藻油中蝦青素酯的HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0023] 一、降解蝦青素酯菌株的篩選
[0024] 本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基配方如下：
[0025] 1)富集培養(yǎng)基
[0026] NH4NO3 0· 1 %，KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0· 001 %，膽固 醇油酸酯〇. 1%，自來水配，pH 7. 0，115°C滅菌30min。
[0027] 2)篩選平板固體培養(yǎng)基（固體篩選平板）
[0028] NH4NO3 0· 1 %，KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0· 001 %，膽固 醇油酸酯（L〇%Triton X-100助溶）0· 1%，瓊脂2%，自來水配，pH 7.0，115°C滅菌30min。
[0029] 3)發(fā)酵培養(yǎng)基
[0030] 雨生紅球藻油發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0. 001 %，牛肉膏0.1 %，蛋白胨I %，雨生紅球藻油（0. 4% Tween80助溶）0. 5%，自來水配， pH 7. 0,115°C滅菌 30min。
[0031] 膽固醇油酸酯發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO4 (λ 025%，MgSO4 · 7Η20 (λ 025%，FeSO4 · 7H20 0.001%，牛肉膏 0.1%，蛋白胨 L0%，膽固醇油酸酯 0.1%，Tween 80 0.4%，pH 7.0， 115°C高壓滅菌30min。
[0032] 4)種子培養(yǎng)基
[0033] 牛肉膏0.3%，蛋白胨l%，NaCl 0.3%，自來水配，pH 7.0，115°C高壓滅菌30min。
[0034] 1、菌株的篩選過程
[0035] I. 1富集培養(yǎng)
[0036] 將配制的富集培養(yǎng)基IOOmL于250mL三角瓶中，滅菌備用。將3g取自屠宰場的土 樣加入到三角瓶中，混合均勻后，在37°C 180rpm下培養(yǎng)24h。
[0037] I. 2平板初篩
[0038] 取富集培養(yǎng)的菌液進行100倍的適度稀釋，涂布于固體篩選平板上；置于37°C培 養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)48h。
[0039] L 3發(fā)酵復篩
[0040] (1)菌株富集挑選平板初篩得到的陽性菌株于滅菌的種子培養(yǎng)基中，在 37°C 180rpm下富集培養(yǎng)24h。
[0041] (2)發(fā)酵培養(yǎng)取富集培養(yǎng)后的菌液lmL，接種至滅菌的含雨生紅球藻油發(fā)酵培養(yǎng) 基的三角瓶（100mL/250mL)中，然后將三角瓶置于恒溫培養(yǎng)箱內，于37°C 180rpm下震蕩培 養(yǎng)48h，取發(fā)酵液進行產物檢測。
[0042] A、薄層層析法檢測
[0043] 發(fā)酵結束后，取ImL發(fā)酵液用二氯甲烷反復萃取，直至水相為無色。用毛細管吸取 萃取液，點樣于硅膠板上，置于用層析液（正己烷/丙酮=4/1)平衡后的層析缸中，以蝦青 素標準品作為對照，根據R f值判斷是否有蝦青素單體產生。
[0044] B、HPLC 法檢測
[0045] 取ImL發(fā)酵液，加 ImL二氯甲燒，反復震蕩萃取，靜置分層，棄上層水相，下層有機 相用氮氣吹干，并加 ImL有機溶劑（甲醇：甲基叔丁基醚=1:1)進行溶解，過0. 22 μ m有機 膜，上柱分析。為了避免萃取不充分而導致的誤差，發(fā)酵效果以液相譜圖中蝦青素與蝦青素 酯的面積比作為因變量進行考察，面積比數值大，說明發(fā)酵效果好，面積比數值小，說明發(fā) 酵效果欠佳。
[0046] 色譜柱：Develosil C30-UG-5 ;
[0047] 流動相：A為甲醇；B為甲基叔丁基醚；C為超純水；
[0048] 流速：lmL/min;
[0049] 檢測器：DAD ;
[0050] 檢測波長：476nm ;
[0051] 溫度：25 °C;
[0052] 進樣量：20 μ L。
[0053] 采用梯度洗脫程序，洗脫條件如表1所示。
[0054] 表1 :蝦青素分離梯度洗脫程序
【主權項】
1. 一種寡養(yǎng)單胞菌，其特征在于，所述的寡養(yǎng)單胞菌的保藏編號為CGMCC NO. 10672。
2. 權利要求1所述的寡養(yǎng)單胞菌用于發(fā)酵生產游離蝦青素。
3. -種生產游離蝦青素的方法，其特征在于，所述的方法是在添加有蝦青素酯或提供 蝦青素酯的原料的培養(yǎng)基中接種權利要求1所述的寡養(yǎng)單胞菌來發(fā)酵制備游離蝦青素。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的含有蝦青素酯的原料為雨生紅球藻 油和/或水生動物的有機溶劑提取物。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的水生動物為含有蝦青素酯的水生動 物。
6. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的水生動物為蝦類或蟹類。
7. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基的組成如下：雨生紅球藻油 和/或含有蝦青素酯的水生動物有機溶劑提取物、KH 2PO4 0? 025%、MgSO4 ? 7H20 0? 025%、 FeSO4 ? 7H20 0? 001%、牛肉膏 0? 1%、蛋白胨 1%，pH 7. 0。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基中添加有Tween-80。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種蝦青素酯酶生產菌株及其在游離蝦青素制備中的應用，本發(fā)明的生產脂肪酶和酯酶的菌株為寡養(yǎng)單胞菌，保藏編號為CGMCC NO.10672。本發(fā)明提供了一株高效利用雨生紅藻油和/或水生動物(如蝦及蟹)有機溶劑提取物生產游離蝦青素的寡養(yǎng)單胞菌菌株，該菌株能夠高效的降解蝦青素酯制備游離蝦青素。而且，本發(fā)明通過實驗，確定發(fā)酵液中吐溫80添加量、接種量、發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時間條件，從而提供了一種高效的制備游離蝦青素的方法。CGMCC NO.1067220150330
【IPC分類】C12N1-20, C12P23-00, C12R1-01
【公開號】CN104877944
【申請?zhí)枴緾N201510323743
【發(fā)明人】毛相朝, 董浩, 薛長湖
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年6月14日