漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNase及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學以及基因工程相關技術研宄領域，特別是具有抗真菌活性的漾濞大泡核桃核糖核酸酶基因JsRNasemm。
【背景技術】
[0002]植物病害在農業(yè)生產中是一個非常棘手的問題，人類與植物病害的斗爭貫穿于農業(yè)的發(fā)展與進步之中。興起于20世紀初期的經典遺傳學使人們能夠通過雜交育種成功地培育出新的抗病品種，大幅度地提高糧食產量。近年來，隨著分子生物學理論和技術的不斷發(fā)展完善，人們能夠通過基因工程這一現代生物技術直接、快速和高效地培育抗病新品種和新材料，是提高植物抗病性的一種新方法。
[0003]核糖核酸酶(Ribonucleases，RNase)可以分解RNA，普遍存在于各種生物體內，包括病毒、細菌、真菌、原生動物、動物和植物。根據序列同源性以及最適pH，RNase被分為堿性核糖核酸酶(Alkaline RNase) I和酸性核糖核酸酶(Acid RNase) II兩類。第I類的RNase的最適pH為7.0?8.0，根據來源、分子量以及作用位點特異性，第I類又分為A (RNase Tl家族)和B亞類(RNase A家族。亞類A的成員主要是來源于微生物，分子量為11?12 kDa，作用底物有鳥苷酸特異性；亞類B成員主要來源于脊椎動物，分子量約為14kDa，作用底物具有嘧啶特異性。第II類只包含T2類RNase，即RNase T2家族，最適pH為
4.0?5.0，分子量大于20 kDa，一般為24?36 kDa，此類RNase的分布較廣，且沒有發(fā)現其作用底物的特異性(Deshpande RA, Shankar V.Ribonucleases from T2 family.Criticalreviews in microb1logy.2002，28: 79 - 122.)0
[0004]植物RNase T2家族分為兩個不同的亞類:S-RNases和S-1ike RNases0雌蕊等植物組織是病原菌營養(yǎng)的豐富來源，產生于雌蕊的RNases與蛋白酶抑制劑和其他植物防御蛋白結合起來抵御病原菌侵染植物(Green PJ.The ribonucleases of higherplants.Annual review of plant b1logy.1994，45: 421 - 445.)。在植物種子中發(fā)現的 S-like RNases，如來自苦瓜、Momordica charantia)的 RNase MCI，來自絲瓜{Luffacylindrica)的RNase LCl和LC2等，作者認為它們可以保護種子免遭病原菌的侵害(IrieM.Strueture-funct1n relat1nships of acid ribonucleases: lysosomal, vacuolar,and periplasmic enzymes.Pharmacology & therapeutics.1999，81: 77 - 89.)0
[0005]Galiana等人發(fā)現煙草{Nicotdana tabacum)葉片接種病原真菌
parasitica var.后，煙草胞外編碼S-like RNase NE的基因快速表達，且該蛋白的活性可以抑制真菌的侵入(Galiana Ej Bonnet P，Conrod S，et al.RNaseactivity prevents the growth of a fungal pathogen in tobacco leaves andincreases upon induct1n of systemic acquired resistance with elicitin.PlantPhys1logy.1997，115: 1557 - 1567.) 0 黑腔病菌、Ρ.parasitica)的侵染可以誘導煙草核糖核酸酶/I?基因的表達，純化的RNase NE蛋白能在體外抑制黑脛病菌和尖孢鐮刀菌{Fusarium oxysporum)游動孢子的菌絲生長，外源施加RNase NE蛋白也能抑制煙草葉片上真菌菌絲的生長(Hugot K, Ponchet M, Marais A, et al.A tobacco S-1ikeRNase inhibits hyphal elongat1n of plant pathogens.Molecular plant—microbeinteract1ns.2002, 15: 243 - 250.)。
[0006]本發(fā)明中核糖核酸酶基因JsRNas巍自漾擤大泡核桃(Juglans sigiIla taDode)。漾濞大泡核桃是目前云南主要的核桃栽培品種，具有果大、殼薄、仁白、味香、出油率高、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，并對病原真菌膠孢炭疽菌iCoIletotrichum gloeospor1ides)具有較強的抗性。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種從漾濞大泡核桃中克隆獲得具有抗真菌活性的核糖核酸酶的全長基因/d&VaM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因全長為943bp，包含一個684 bp的開放閱讀框、76 bp的5'非翻譯區(qū)(untranslated reg1ns，UTR)及183 bp的:V UTR，編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質。
[0008]本發(fā)明所述核糖核酸酶基因/d&VaM的編碼區(qū)是序列表SEQ ID NO:1中第77-760位所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明分離克隆漾濞大泡核桃的一個抗真菌相關基因的完整cDNA片段，通過根癌農桿菌Uigrobacterium tumefaciens)介導將目的基因轉入受體植物中過量表達，并通過進一步實驗驗證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎，發(fā)明人將這個基因命名為JsRNase。
[0010]植物s-like RNase為核糖核酸酶T2家族成員，參與植物磷酸回收、植物衰老和抗逆等生理過程。RNase在生物和非生物脅迫下誘導表達，在防衛(wèi)反應中起重要作用，能抵抗病毒、真菌等病原物的侵染，是植物防御系統(tǒng)中重要的組成成分，超表達因能提高轉基因植物的抗病性。
[0011]本發(fā)明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表所示，對該基因進行分析，表明全長cDNA為943 bp，包含一個684 bp的開放閱讀框、76 bp的5r UTR及183 bp的:V UTR，其中ORF編碼一個具有227個氨基酸的蛋白質。編碼蛋白具有RNase T2家族的保守結構域，與來自白梨{pyrus bretschneideri)、、\\桑_ (Morusnotabilis)和蘋果{Malus domes tica)以及其他植物的RNase蛋白具有較高相似性，這表明其屬于漾濞大泡核桃中的核糖核酸酶基因。超表達序列表SEQ ID NO:1所示序列可以增強煙草對膠孢炭疽菌、核盤菌{Sclerotinia、尖孢鐮刀菌{Fusariumoxysporum)以及串珠狀赤霉菌{Gibberella moniIiformis)的抗性。
[0012]上述因可以應用于提高煙草的抗真菌特性，具體操作如下:
(I)采用擴增的特異引物，從接種膠孢炭疽菌后的漾濞大泡核桃葉中提取總RNA，通過逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcript1n-polymerase chainreact1n，RT-PCR)擴增出的全長編碼區(qū)，然后將其連接到pMD_18T載體上，經測序獲得具有目的基因的克隆。
[0013](2)用限制性內切酶BaiMi和&oRI酶切ρΜ018-Τ-/^?Λ&^載體和植物表達載體PCAMBIA2300S，通過膠回收得到目的基因片段和載體大片段，再將所獲得因片段與pCAMBIA2300S載體片段連接，構建植物超表達載體，之后將所構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入煙草中表達。
[0014](3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過PCR以及RT-PCR檢測得到陽性轉基因植株，分析轉基因植株對于病原真菌的抗性，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。
[0015]本發(fā)明為提高植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物可以克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明中來自漾濞大泡核桃的因能增強植物對幾種病原真菌的抗性，將該基因導入煙草中，可以產生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術培育抗性植物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢和不可取代的重要性。它不僅可以為大規(guī)模生產作物、花丼等提供方便，減少化學農藥的使用，還可以為農業(yè)生產節(jié)約成本、減少環(huán)境污染，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應用前景。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明中部分轉基因煙草基因組DNA的PCR檢測結果，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，000 bp、l，000 bp、750 bp、500 bp、250bp以及100 bp六條DNA片段組成；正對照:質粒ρΜ?18-Τ-/^?Μ^為模板的PCR反應；WT:非轉基因煙草(野生型)總DNA為模板進行的PCR ;
圖2是本發(fā)明中部分陽性/d&VaM轉基因煙草中轉錄水平的表達分析結果，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物);WT:非轉基因煙草總RNA逆轉錄cDNA為模板的PCR產物；正對照:質粒pMD18-T-/^.^為模板的PCR產物；
圖3是本發(fā)明中轉基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果圖；其中a、b、c、d圖示中的真菌分別是核盤菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌以及尖孢鐮刀菌；WT為野生型煙草的總蛋白；CK為空白對照，即無蛋白對照(用于提取蛋白的緩沖液)。
【具體實施方式】
[0017]下面通過附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內容，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0018]實施例1 'JsRNase^ cDNA克隆以及序列分析
用膠孢炭疽菌接種漾濞大泡核桃，用接種后4 h的葉提取總RNA，用液氮將處理過的漾濞大泡核桃的葉研磨成粉末，然后轉入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉錄酶M-MLV (promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系和操作過程為:取5 μ g總 RNA，依次加入 50 ng oligo (dT)，2 μ L dNTP Mix (2.5mM each)，用 DEPC 水將反應體積補齊至14.5 μ L ;混勻后，70°C加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻5 min，然后依次加入4yL 5 X First-stand buffer,0.5 yL RNasin (200U)、1 μ L M-MLV (200U)，混勻并簡短離心，42°0溫浴1.5 h，取出后70°C加熱10 min，終止反應。cDNA第一鏈合成后置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0019]以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因所用上下游引物序列分別為 5 0 -ACCCACATTACAGCAAAAGATAGAC-3 0 及 5 0 -ATTACAGTGGTTACTTGAATTGATGA-3 0。采用Advantage? 2 PCR Enzyme (Clontech)擴增出目的基