低溫誘導(dǎo)高效異源表達(dá)載體pSW4及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉一種穿梭質(zhì)粒的最小化及其應(yīng)用，具體是涉及一種以噬菌體為基礎(chǔ)的穿 梭質(zhì)粒PSW2最優(yōu)化改造和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明基于改造了一株專利CN103333908A所述質(zhì)粒PSW2,其來源于深海 細(xì)菌希瓦氏菌WP3 (Shewanellapiezotolerans WP3)的絲狀菌體（已經(jīng)發(fā)表于 《shewanellapsychrophila sp.nov. and Shewanellapiezotolerans sp.nov. , isolated from west Pacific deep-sea sediment》，2007)。卩莖菌體是一種專以細(xì)菌為宿主的病毒， 其遺傳物質(zhì)由蛋白質(zhì)外殼所包裹。當(dāng)噬菌體SWl侵染W(wǎng)P3時(shí)，它可以整合到WP3的基因組 上，也可以產(chǎn)生雙鏈的復(fù)制形式，以此為基礎(chǔ)將其改造成為適應(yīng)宿主WP3的天然質(zhì)粒載體。 本專利改造的專利CN103333908A所述質(zhì)粒pSW2,其基因組全才度為6451bp，含有6個(gè)可能 的開放閱讀框，編碼與其生命活動(dòng)相關(guān)的蛋白組分，如噬菌體復(fù)制單元，結(jié)構(gòu)單元，組裝單 元與調(diào)控單元。
[0003] 低溫表達(dá)體系不僅能大大降低蛋白包涵體的形成，并且能夠顯著提高異源蛋白的 穩(wěn)定性，特別見于一些熱敏感蛋白。深海細(xì)菌Shewanella piezotolerans WP3分離自深海 低溫沉積物，表現(xiàn)出明顯適應(yīng)低溫的特性，其最適生長(zhǎng)溫度為20°C，在4°C下也具有很高的 生物量。WP3的天然噬菌體SWl具有低溫誘導(dǎo)的特性，在4°C條件下蛋白表達(dá)量相較于20°C 有顯著提高。以此為基礎(chǔ)，專利CN103333908A所述質(zhì)粒pSW2可作為適應(yīng)宿主WP3的低溫 誘導(dǎo)的異源表達(dá)載體，同時(shí)也適用于本底表達(dá)深海來源的異源蛋白。
[0004] 目前，在大腸桿菌和希瓦氏菌中都能夠復(fù)制表達(dá)的以噬菌體為基礎(chǔ)的穿梭質(zhì)粒只 在專利CN103333908A所述質(zhì)粒PSW2所報(bào)導(dǎo)，雖然PSW2可以表達(dá)異源蛋白，但是其低溫誘 導(dǎo)效率偏低，并且其質(zhì)粒存在許多累贅片段，其存在既消耗能量降低蛋白表達(dá)量且降低載 體通載量。因此，對(duì)其改造有很大的實(shí)際的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于將一種既能夠在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制表達(dá)、也可以在不同的希瓦氏 菌中復(fù)制表達(dá)的以噬菌體為基礎(chǔ)的穿梭質(zhì)粒PSW2優(yōu)化，同時(shí)提供以GFP為報(bào)告基因的高 效異源表達(dá)篩選載體。本發(fā)明還提供了制備上述PSW4及其衍生質(zhì)粒的方法和其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種以噬菌體為基礎(chǔ)的穿梭質(zhì)粒pSW4,其堿基序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0008] 所述穿梭質(zhì)粒pSW4是以專利CN103333908A所構(gòu)建的載體pSW2為基礎(chǔ)，改造優(yōu)化 成為低溫誘導(dǎo)高效異源表達(dá)載體。
[0009] 第二方面，本發(fā)明提供一種所述穿梭質(zhì)粒pSW4的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟一，敲除質(zhì)粒pSW2上FpsB序列；
[0011] 步驟二，啟動(dòng)子PR1869及RBS序列的克?。?br>[0012] 步驟三，His-Tag的克隆；
[0013] 步驟四，連接報(bào)告基因 GFP篩選高效表達(dá)株。
[0014] 優(yōu)選的，在步驟一中，所述FpsB序列預(yù)測(cè)為單鏈結(jié)合蛋白（SSB，ssDNA binding protein)〇
[0015] 優(yōu)選的，在步驟二中，所述啟動(dòng)子PR1869來源于WP3的冷激蛋白（Cold shock protein)〇
[0016] 優(yōu)選的，在步驟三中，所述His-Tag來源于序列合成。
[0017] 優(yōu)選的，在步驟四中，所述GFP為綠色焚光蛋白（green fluorescent protein)。
[0018] 第三方面，本發(fā)明提供一種所述以噬菌體為基礎(chǔ)的穿梭質(zhì)粒pSW4的衍生質(zhì)粒的 構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0019] 步驟一，在專利CN103333908A所述穿梭質(zhì)粒pSW2的多克隆位點(diǎn)引入GFP作為報(bào) 告基因；
[0020] 步驟二，質(zhì)粒擴(kuò)增驗(yàn)證并轉(zhuǎn)化于感受態(tài)WM3064菌株，菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證；
[0021] 步驟三，以深海細(xì)菌希瓦氏菌WP3作為低溫蛋白表達(dá)宿主，將突變型 WM3064-pSW3-GFP與希瓦氏菌WP3接合轉(zhuǎn)移；
[0022] 步驟四，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定20°C與4°C下GFP的表達(dá)強(qiáng)度，篩選高效表達(dá)株；以對(duì) 比改造后PSW3與原始pSW2對(duì)目的蛋白的表達(dá)率影響。
[0023] 第四方面，本發(fā)明提供一種所述以噬菌體為基礎(chǔ)的穿梭質(zhì)粒pSW4在利用外源基 因表達(dá)低溫蛋白中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種上述以噬菌體為基礎(chǔ)的穿梭質(zhì)粒pSW4在希瓦氏菌中基因回 補(bǔ)的應(yīng)用。
[0025] 本專利在已有專利CN103333908A所構(gòu)建的載體pSW2為基礎(chǔ)對(duì)其進(jìn)行最優(yōu)化改造 以增大通載量以及提高質(zhì)粒穩(wěn)定性和異源表達(dá)效率，其構(gòu)建穿梭質(zhì)粒能夠在多種宿主細(xì)胞 內(nèi)復(fù)制并表達(dá)外源蛋白。同時(shí)本專利運(yùn)用綠色焚光蛋白（green fluorescent protein)，簡(jiǎn) 稱GFP，其基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色熒光，故可以作 為基因表達(dá)的報(bào)告基因，進(jìn)行最小化刪減。構(gòu)建PSW4,能夠在低溫下更高效的表達(dá)外源蛋 白。高效的低溫啟動(dòng)子配合宿主菌WP3的低溫生長(zhǎng)特性，為表達(dá)熱敏蛋白提供了一個(gè)新的 工具。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
[0027] (1)低溫誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)不通過誘導(dǎo)劑而僅僅依靠溫度改變來實(shí)現(xiàn)蛋白誘 導(dǎo)，可用于原位表達(dá)深海來源的蛋白等。
[0028] (2)該穿梭質(zhì)粒在4°C條件下大大降低外源蛋白包涵體的生成，穩(wěn)定蛋白性能，增 加了啟動(dòng)子序列后，PSW4相較于pSW2在20°C與4°C條件下GFP表達(dá)量都大大提升。
【附圖說明】
[0029] 通過閱讀參照以下附圖對(duì)改造實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的 和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0030] 圖1是pSW4質(zhì)粒改造說明圖，
[0031] 圖2是pSW2與pSW2 Λ FpsB大小對(duì)照?qǐng)D，
[0032] 圖 3 是 pSW2 與 pSW2+PR1869+His-Tag 大小對(duì)照?qǐng)D，
[0033] 圖4是pSW4質(zhì)粒拷貝數(shù)的鑒定結(jié)果圖，
[0034] 圖5是不同溫