一種提高植物抗逆性的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高植物抗逆性的方法及其應(yīng)用，屬于植物轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆對干旱、鹽堿等逆境脅迫十分敏感，逆境導(dǎo)致大豆品質(zhì)和產(chǎn)量下降。因此，研 宄抗逆相關(guān)基因，明確抗逆分子機制，提高大豆抗逆性非常重要。隨著分子生物技術(shù)的發(fā) 展，將抗逆基因轉(zhuǎn)入相關(guān)作物中，使其在目的作物中高效表達，從而提高作物對逆境環(huán)境的 適應(yīng)性，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)已成為目前研宄的重點。但是，關(guān)于大豆中AKTl類基因相關(guān) 信息的研宄還很少，尚沒有利用AKTl類基因改善植物抗逆性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種提高植物抗逆性的方法，采取的技術(shù)方案如 下：
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高植物抗逆性的方法，其特征在于，通過PCR擴增 獲得抗逆基因后，構(gòu)建植物表達載體，再將植物表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌上，再利用含有表達 載體的農(nóng)桿菌侵染目標植物，培育被侵染的目標植物至獲得轉(zhuǎn)抗逆基因的種子。
[0005] 所述方法的步驟如下：
[0006] 1)提取大豆子葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，并以所得CDNA為模板，進行PCR擴 增，獲得抗逆基因；
[0007] 2)將步驟1)所擴增的抗逆基因插入到質(zhì)粒載體上獲得植物表達載體；
[0008] 3)再將步驟2)所得的植物表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌上，獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子；
[0009] 4)利用步驟3)所得的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子侵染目標植物，獲得侵染植物；
[0010] 5)培育侵染植物至獲得含有抗逆基因的種子。
[0011] 優(yōu)選地，步驟1)所述大豆，品種為東農(nóng)50 ;所述抗逆基因，抗逆基因 GmAKTl， GeneBank登陸號為KM491715. 1 ;所述PCR擴增，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示；擴增條件為：94°C 2min ;再進行38個循環(huán)，其中每個循環(huán)降0. 2°C:98°C 10s， 58°C 30s，68°C 3min ;68°C終延伸 lOmin。
[0012] 優(yōu)選地，步驟2)所述質(zhì)粒載體，是質(zhì)粒載體pCXSN。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3)所述將植物表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌上，是將植物表達載體通過凍 融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌EHA105中。
[0014] 優(yōu)選地，步驟4)所述目標植物為擬南芥或大豆，侵染部位為花絮；所述侵染是將 擬南芥的花絮浸入到轉(zhuǎn)化液中28-32s。
[0015] 所述轉(zhuǎn)化液，是將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子在室溫5000rpm下離心10min后，再將沉淀菌液懸 浮在1/2MS緩沖液中，加入表面活性劑SilwetL-77制得。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)提取東農(nóng)50大豆子葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，以所得cDNA為模板， 以如SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，擴增條件為： 94°C 2min;再進行 38 個循環(huán)，其中每個循環(huán)降 0. 2°C :98°C 10s，58°C 30s，68°C 3min;68°C 終延伸lOmin，獲得抗逆基因 GmAKT I擴增產(chǎn)物；
[0018] 2)通過XcmI和Hind III的酶切作用將步驟1)所得的抗逆基因 GmAKT 1擴增產(chǎn) 物連接到質(zhì)粒載體PCXSN上，獲得植物表達載體pCXSN-GmAKTl ;
[0019] 3)通過凍融法將步驟2)所得的植物表達載體pCXSN-GmAKTl轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌 EHA105中，獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子pCXSN-GmAKTl ;
[0020] 4)將步驟3)所得的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子pCXSN-GmAKTl在室溫5000rpm下離心10min 后，再將沉淀菌液懸浮在1/2MS緩沖液中，加入表面活性劑SilwetL-77制得轉(zhuǎn)化液，將擬南 芥的花絮浸入到轉(zhuǎn)化液中30s后取出，獲得侵染擬南芥；
[0021] 5)平放步驟4)所得的侵染擬南芥，避光，保鮮膜包裹保持濕度，暗培養(yǎng)Id后，取出 除去遮擋，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至獲得轉(zhuǎn)抗逆基GmAKTl的擬南芥種子。
[0022] 所述任一方法用于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因育種。
[0023] 優(yōu)選地，所述任一方法用于培育抗逆性提高的農(nóng)作物；更優(yōu)選地，用于培育抗逆性 提尚的大?。
[0024] 發(fā)明人從大豆DN50中分離了一個新基因 GmAKTl，雖然發(fā)明人公開了該基因的堿 基序列，但是對于該基因的功能并未披露。對于基因 GmAKTl尚無功能研宄報道。
[0025] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0026] 發(fā)明人對組織特異性進行分析，發(fā)現(xiàn)GmAKTl在大豆根部表達量高于其他組織，在 受到ABA、NaCl及PEG誘導(dǎo)時，其表達量顯著升高。原核表達實驗證明獲得的大豆GmAKTl 基因可以編碼翻譯目的蛋白。將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，得到了轉(zhuǎn)GmAKTl擬南芥，轉(zhuǎn)GmAKTl擬南 芥表現(xiàn)出蓮座葉少，開花早，莢數(shù)多，株高增加的特性，與野生型相比有一定程度的生理優(yōu) 勢。GmAKTl提高了擬南芥的抗旱及抗鹽能力，轉(zhuǎn)入突變體擬南芥時，可以將突變體擬南芥對 鹽、旱的超敏感恢復(fù)到正常水平。GmAKTl增加了擬南芥種子在萌發(fā)時期對ABA的敏感性，而 AKTl基因缺失則導(dǎo)致擬南芥對ABA的不敏感。同時，GmAKTl的過表達可以在一定程度上清 除逆境時植物體內(nèi)的活性氧。
【附圖說明】
[0027] 圖I GmAKTl的序列差異性分析。
[0028] 圖2 GmAKTl蛋白與GmAKT2蛋白、水稻OsAKTl、擬南芥AKTl蛋白的氨基酸比對。
[0029] 圖3 GmAKTl組織表達分析及PEG、NaCl、ABA處理的大豆GmAKTl基因的相對表達 量。
[0030] 圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型。
[0031] 圖5不同ABA濃度處理下種子的萌發(fā)率。
[0032] 圖6水分脅迫處理下種子的萌發(fā)率、根長變化及擬南芥離體葉片失水率。
[0033] 圖7不同NaCl濃度處理下種子的萌發(fā)率、根長及表型變化。
[0034] 圖8 NBT染色檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中超氧陰離子的含量。
[0035] 圖9 DAB染色檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中H2O2的含量。
【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0037] 以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0038] 實施例1GmAKTl的獲得
[0039] 一、GmAKTl的克隆及生物信息學(xué)分析
[0040] 從Phytozome數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥AKTl的同源基因，利用同源克隆的方法從東 農(nóng)50中獲得同源性最高的2個基因拷貝，分別位于17號染色體和5號染色體，氨基酸同源 率分別為69. 41%和68. 00%，命名為GmAKTl，GmAKT2。本發(fā)明克隆的GmAKTl含有一個長 2628bp的開放閱讀框，編碼875個氨基酸。
[0041] Trizol試劑提取大豆（Glycine max)(東農(nóng)50,武天龍，楊慶凱，馬占峰，吳宗璞， 趙淑文，高鳳蘭，李文濱，張國棟，楊琪，孟慶喜，王金陵.東農(nóng)小粒豆1號大豆新品種選育報 告，[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994,（25) 1:104;公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以下簡稱為野 生型大豆）。葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈作為模板，以SEQ ID NO. 3-4所示序列 為引物，進行PCR 反應(yīng)，PCR 條件為 94°C 2min ;38 循環(huán)：98°C 10s，58°C 30s，68°C 3min ;(每 個循環(huán)降0. 2°C )68 °C終延伸IOmin。經(jīng)測序，PCR產(chǎn)物為2707bp，有兩個堿基與大豆數(shù)據(jù) 庫中比對得到的不同，序列中第17Ibp由T變?yōu)锳，第501個bp由G變?yōu)锳，從而導(dǎo)致第168 個氨基酸由甘氨酸變?yōu)榻z氨酸（圖1)。該基因命名為GmAKTl。由于數(shù)據(jù)庫中的GmAKTl序 列來自于威廉姆斯82號大豆，而本申請中所克隆的GmAKTl于東農(nóng)50中分離，品種的差異 可能引起氨基酸的變異。本申請克隆的大豆GmAKTl在GenBank登陸號為KM491715. 1。
[0042] GmAKTl的分子量為98137. 58,等電點7. 09,負電殘基（Asp+Glu)為90,正電殘基 (Arg+Lys)是89。原子組成為4408個C、6911個H、1195個N、1277個0、33個S,化學(xué)式為 C44tl8H6911N1195O1277S 33，原子總數(shù)是13824個（圖2)。預(yù)測GmAKTl蛋白有5個跨膜區(qū)域，分別 位于52-74,84-106,190-212, 232-254, 267-289,其中在S4跨膜區(qū)域上，發(fā)現(xiàn)一個P結(jié)構(gòu)域， 是鉀離子通道Shaker家族的結(jié)構(gòu)的基本特征。
[0043] 二、GmAKTl的表達分析
[0044] 1、大豆GmAKTl基因的組織特異性表達
[0045] 用半定量法分析了 GmAKTl在大豆各個組織器官的表達情況。于大豆盛花期取 DN50根、莖、葉、莢、豆、花等各個組織部分，用Trizol試劑盒提取RNA，調(diào)整RNA濃度后以總 RNA為模板，分別反轉(zhuǎn)錄各組織cDNA。以大豆管家基因 actin為內(nèi)參調(diào)整擴增目的基因的 模板量。反應(yīng)條件為：94°C 5min ;34 循環(huán)：94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s72°C，終延伸 lOmin。 (圖