用于檢測(cè)玉米植物dbn9981的核酸序列及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)玉米植物DBN9981的核酸序列及其檢測(cè)方法，特別是涉 及一種對(duì)昆蟲具有抗性且耐受草甘膦除草劑施用的轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981和用于檢測(cè) 生物樣品中是否包含特定轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的核酸序列及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米（Zea mays L.)在世界上很多地區(qū)都是主要的糧食作物。生物技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用 于玉米以改善其農(nóng)藝性狀和品質(zhì)。在玉米生產(chǎn)中昆蟲抗性是一項(xiàng)重要的農(nóng)藝性狀，特別是 對(duì)鱗翅目昆蟲的抗性，例如玉米螟、棉鈴蟲、黏蟲等。玉米對(duì)鱗翅目昆蟲的抗性可以通過轉(zhuǎn) 基因的方法使鱗翅目昆蟲的抗性基因在玉米植物中表達(dá)而獲得。另一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀是 除草劑耐受性，特別是耐受草甘膦除草劑。玉米對(duì)草甘膦除草劑的耐受性可以通過轉(zhuǎn)基因 的方法使草甘膦除草劑耐受型基因（如EPSPS)在玉米植物中表達(dá)而獲得。
[0003] 已知外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)受到它們的染色體位置的影響，可能是由于染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)（如異染色質(zhì)）或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件（如增強(qiáng)子）接近整合位點(diǎn)。為此，通常需要篩選大 量的事件才有可能鑒定出可以商業(yè)化的事件（即導(dǎo)入的目標(biāo)基因得到最優(yōu)表達(dá)的事件）。 例如，在植物和其他生物體中已經(jīng)觀察到導(dǎo)入基因的表達(dá)量在事件間可能有很大差異；在 表達(dá)的空間或時(shí)間模式上可能也存在差異，如在不同植物組織之間轉(zhuǎn)基因的相對(duì)表達(dá)存在 差異，這種差異表現(xiàn)在實(shí)際的表達(dá)模式可能與根據(jù)導(dǎo)入的基因構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件所 預(yù)期的表達(dá)模式不一致。因此，通常需要產(chǎn)生成百上千個(gè)不同的事件并從這些事件中篩選 出具有以商業(yè)化為目的所預(yù)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量和表達(dá)模式的單一事件。具有預(yù)期的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)量和表達(dá)模式的事件可用于采用常規(guī)育種方法通過有性異型雜交將轉(zhuǎn)基因滲入到其 他遺傳背景中。通過這種雜交方式產(chǎn)生的后代保持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。應(yīng)用 這種策略模式可以確保在許多品種中具有可靠的基因表達(dá)，而這些品種能很好的適應(yīng)當(dāng)?shù)?的生長(zhǎng)條件。
[0004] 能夠檢測(cè)特定事件的存在以確定有性雜交的后代是否包含目的基因?qū)⑹怯幸娴摹?此外，檢測(cè)特定事件的方法還將有助于遵守相關(guān)法規(guī)，例如來源于重組農(nóng)作物的食物在投 入市場(chǎng)前需要獲得正式批準(zhǔn)和進(jìn)行標(biāo)記。通過任何熟知的多核苷酸檢測(cè)方法來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因 的存在都是可能的，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)或利用多核苷酸探針的DNA雜交。這些檢 測(cè)方法通常集中于常用的遺傳元件，例如啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等。因此，除非與插入的 轉(zhuǎn)基因 DNA相鄰的染色體DNA( "側(cè)翼DNA"）的序列是己知的，上述這種方法就不能夠用于 區(qū)別不同的事件，特別是那些用相同的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的事件。所以，目前常利用跨越了插 入的轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼DNA的接合部位的一對(duì)引物通過PCR來鑒定轉(zhuǎn)基因特定事件，具體地說 是包含于側(cè)翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)玉米植物DBN9981的核酸序列及其檢測(cè)方法， 轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981對(duì)昆蟲具有較好的抗性并對(duì)草甘膦除草劑具有較好的耐受性，且 檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確快速的鑒定生物樣品中是否包含特定轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA分 子。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種核酸序列，SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中至少 11個(gè)連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0007] 優(yōu)選地，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID NO: 2或其 互補(bǔ)序列。
[0008] 進(jìn)一步地，所述核酸序列包括SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID N0:4或 其互補(bǔ)序列。
[0009] 更進(jìn)一步地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:5或其互補(bǔ)序列。
[0010] 所述SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981中在插入序列的5' 末端位于插入接合部位附近的一個(gè)長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:1或其互補(bǔ) 序列跨越了玉米插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA序列和插入序列的5'末端的DNA序列，包含所 述SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的存在。所述SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一個(gè)長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列跨越了插入序列的 3'末端的DNA序列和玉米插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA序列，包含所述SEQ ID NO: 2或其互 補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的存在。
[0011] 本發(fā)明中，所述核酸序列可以為所述SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中轉(zhuǎn)基因插入序 列的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸（第一核酸序列），或者為所述SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)序列中5'側(cè)翼玉米基因組DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù) 多核苷酸（第二核酸序列）。所述核酸序列進(jìn)一步可以為同源于或互補(bǔ)于包含完整的所述 SEQ ID NO: 1的所述SEQ ID N0:3的一部分。當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄泻偷诙怂嵝蛄幸黄鹗褂?時(shí)，這些核酸序列在產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA擴(kuò)增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對(duì)在 DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物是包括SEQ ID NO: 1的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以診斷轉(zhuǎn)基因玉米 事件DBN9981或其后代的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，第一和第二核酸序列不必僅僅由 DNA組成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作為一種或多種聚合 酶模板的核苷酸或其類似物的組合。此外，本發(fā)明中所述探針或引物應(yīng)該是至少大約11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)連續(xù)核苷酸的長(zhǎng)度，其可以選自SEQIDN0 :1、 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 中所述的核苷酸。當(dāng)選自 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示的核苷酸時(shí)，所述探針和引物可以為長(zhǎng)度是至 少大約21個(gè)到大約50個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸。所述SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因 玉米事件DBN9981中在插入序列的5'末端位于插入接合部位附近的一個(gè)長(zhǎng)度為1381個(gè)核 苷酸的序列，所述SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列由1195個(gè)核苷酸的玉米側(cè)翼基因組DNA序列 (SEQIDN0:3的核苷酸1-1195)、51個(gè)核苷酸的DBN10124構(gòu)建體DNA序列（SEQIDN0:3 的核苷酸1196-1246)和135個(gè)核苷酸的tNos終止子的3'末端DNA序列（SEQ ID NO: 3的 核苷酸1247-1381)組成，包含所述SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件 DBN9981的存在。
[0012] 所述核酸序列可以為所述SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中轉(zhuǎn)基因插入序列的任何部 分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸（第三核酸序列），或者為所述SEQ ID NO :4或其互 補(bǔ)序列中3'側(cè)翼玉米基因組DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸（第 四核酸序列）。所述核酸序列進(jìn)一步可以為同源于或互補(bǔ)于包含完整的所述SEQ ID N0:2 的所述SEQ ID N0:4的一部分。當(dāng)?shù)谌怂嵝蛄泻偷谒暮怂嵝蛄幸黄鹗褂脮r(shí)，這些核酸序 列在產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA擴(kuò)增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對(duì)在DNA擴(kuò)增方法中 產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物是包括SEQ ID N0:2的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981或 其后代的存在。所述SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981中在插入序列 的3'末端位于插入接合部位附近的一個(gè)長(zhǎng)度為1384個(gè)核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:4 或其互補(bǔ)序列由38個(gè)核苷酸的t35S轉(zhuǎn)錄終止子序列（SEQ ID NO: 4的核苷酸1-38)、58個(gè) 核苷酸的DBN10124構(gòu)建體DNA序列（SEQ ID NO: 4的核苷酸39-96)和1288個(gè)核苷酸的玉 米整合位點(diǎn)側(cè)翼基因組DNA序列（SEQ ID N0:4的核苷酸97-1384)組成，包含所述SEQ ID N〇:4或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的存在。
[0013] 所述SEQ ID NO:5或其互補(bǔ)序列為表征轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的長(zhǎng)度為9732 個(gè)核苷酸的序列，其具體包含的基因組和遺傳元件如表1所示。包含所述SEQ ID N0:5或 其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的存在。
[0014] 表1、SEQ ID NO:5包含的基因組及遺傳元件
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸序列，其特征在于，包括SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核 苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:1或其互 補(bǔ)序列、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:3或其 互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:5或其 互補(bǔ)序列。
5. -種檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測(cè)樣品與至少兩種引物在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中接觸； 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)； 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在； 所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID NO:3或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方法，其特 征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷 酸、或者SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方法， 其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列、 SEQ ID N0:6或其互補(bǔ)序列、或者SEQ ID N0:7或其互補(bǔ)序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方 法，其特征在于，所述引物包括至少一種權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述核酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方法，其 特征在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物選自SEQ ID N0:8和SEQ ID NO: 10 ;所述第二引物選自 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 11。
10. -種檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測(cè)樣品與探針接觸，所述探針包括SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù) 的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸； 使所述待檢測(cè)樣品和所述探針在嚴(yán)格雜交條件下雜交； 檢測(cè)所述待檢測(cè)樣品和所述探針的雜交情況。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9981的DNA存在的方法，其 特征在于，所述探針包括SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)序列中第1