改進(jìn)的發(fā)酵方法
【專利說明】改進(jìn)的發(fā)酵方法
[0001 ] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)烴化合物的發(fā)酵方法，所述方法包括在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培 養(yǎng)生物，其中所述生物通過酶促途徑生產(chǎn)想要的烴化合物，所述酶促途徑包含蒸發(fā)到氣相 中的中間物并且其中所述中間物從氣相回收并且再引入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0002] 發(fā)酵方法在多種化合物的供應(yīng)中起重要作用并且通常構(gòu)成化學(xué)方法的重要備選 方法。因?yàn)榘l(fā)酵方法的運(yùn)行成本可以是巨大的，對(duì)提供更加有成本效益的方法有不斷的需 求。降低運(yùn)行成本的嘗試包括，例如，開發(fā)使用顯示降低的能量消耗的代謝途徑用于生產(chǎn)想 要的化合物的重組微生物，開發(fā)具有較高活性的酶，增加底物轉(zhuǎn)化效率，使用較便宜的底物 等。在過去十年中，在發(fā)酵方法的幫助下生產(chǎn)具有工業(yè)興趣（例如作為生物燃料或作為聚 合物的組分）的烴類化合物的嘗試已經(jīng)增加并且同時(shí)已經(jīng)描述了用于在微生物中生產(chǎn)此 類化合物的多種酶促反應(yīng)。相應(yīng)的發(fā)酵方法的開發(fā)通常涉及其本身的問題因?yàn)槠渫ǔＪ褂?涉及不尋常酶促轉(zhuǎn)化的完全新的代謝途徑。
[0003] 本發(fā)明通過提供如權(quán)利要求中所描述的實(shí)施方案解決了對(duì)提供用于生產(chǎn)烴化合 物的改進(jìn)的發(fā)酵方法的需求。
[0004] 特別地，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)烴化合物的發(fā)酵方法，所述方法包括在液體發(fā)酵培 養(yǎng)基中培養(yǎng)生物，其中所述生物通過酶促途徑生產(chǎn)想要的烴化合物，所述酶促途徑包含蒸 發(fā)到氣相中的中間物并且其中所述中間物從氣相回收并且再引入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的方法解決了當(dāng)發(fā)酵過程利用了涉及中間物的代謝途徑時(shí)遇到的問 題，所述中間物由于其化學(xué)和物理性質(zhì)，在所選擇的發(fā)酵條件下具有逸入發(fā)酵裝置的氣相 的傾向。這在一方面導(dǎo)致底物的不充分利用并且在另一方面其減少了發(fā)酵培養(yǎng)基中或生物 本身中的中間物的量，導(dǎo)致使用此中間物作為底物的各個(gè)酶對(duì)中間物的較低的周轉(zhuǎn)。這將 導(dǎo)致整個(gè)過程的整體效率降低，由于中間物的泄露和由于位于中間物下游的代謝途徑的效 力降低。
[0006] 通過從所述氣相回收蒸發(fā)到氣相中的中間物并將其再引入到發(fā)酵中，根據(jù)本發(fā)明 的方法允許對(duì)中間物滲漏的補(bǔ)償并且保持中間物高濃度。保持中間物的高濃度是有利的， 因?yàn)槠浯_保了轉(zhuǎn)化中間物的酶是飽和的并且顯示高周轉(zhuǎn)率。因此，從氣相中回收中間物允 許增強(qiáng)發(fā)酵方法的總體生產(chǎn)力。
[0007] 如本發(fā)明中所用的術(shù)語"發(fā)酵方法"涉及包括使用培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化有機(jī)化合物的 方法。
[0008] 在根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法中使用的生物特征在于其通過酶促途徑生產(chǎn)想要的烴 化合物，即其通過酶促反應(yīng)將有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為想要的烴產(chǎn)物來生產(chǎn)想要的烴化合物。
[0009] 優(yōu)選地，待生產(chǎn)的烴是選自IA類別易燃液體的化合物（即，具有低于 73° F (22. 8°C )的閃點(diǎn)和低于100° F (37. 8°C )的沸點(diǎn)的化合物），選自IB類別易燃液 體的化合物（即，具有低于73° F(22.8°C )的閃點(diǎn)和大于或等于100° F(37.8°C )的沸 點(diǎn)的化合物），選自1C類別易燃液體的化合物（即，具有大于或等于73° F(22.8°C)和 低于100° F(37.8°C )的閃點(diǎn)的化合物），或選自II類可燃燒液體的化合物（即，具有大 于或等于100° F(37.8°C)和低于140° F(60°C)的閃點(diǎn)的化合物），如U.S.National Fire Protection Association 的出版物"NFPA 30, Flammable and Combustible Liquids Code，2012版"中所定義（包括其中提供的閃點(diǎn)和沸點(diǎn)的定義）。更優(yōu)選地，烴是選自IA類 別易燃液體、IB類別易燃液體，或1C類別易燃液體的化合物。
[0010] 烴可以是，例如，烯，并且優(yōu)選是以下式（I)的C2_8烯：
[0012] 其中R1、!?2、!?3和R 4彼此獨(dú)立地選自氫、Cm烷基或C2_6烯基，條件是式（I)的化合 物中碳原子的總數(shù)是2至8的整數(shù)，并且優(yōu)選地2至6的整數(shù)（即，2、3、4、5或6)。
[0013] 優(yōu)選地，烴是選自乙烯、丙烯、丁烯（例如，異丁烯、1-丁烯或2-丁烯）、戊烯、己 烯、庚烯、辛烯（例如，1-辛烯）、丁二烯（例如，1，3-丁二烯）、戊二烯（例如，異戊二烯或 2-甲基-1，3- 丁二烯）、己二烯（例如，2, 3-二甲基-1，3-丁二烯）、庚二烯、或辛二烯的烯。 更優(yōu)選地，烴是乙烯、丙烯、異丁烯、1- 丁烯、2- 丁烯（例如，順-2- 丁烯、反-2- 丁烯或其混 合物）、1，3-丁二烯，或異戊二烯的烯。
[0014] 特別優(yōu)選的產(chǎn)物是異丁烯、1，3-丁二烯、異戊二烯（2-甲基-1，3-丁二烯）或丙 烯。
[0015] 甚至更優(yōu)選地，烴是異丁烯或1，3-丁二烯，并且最優(yōu)選地其為異丁烯。
[0016] 如本文所用，術(shù)語"烴"指這樣的化合物，其由碳原子和氫原子組成并且可以是飽 和的或不飽和的、直鏈的、分枝的或環(huán)狀、非環(huán)狀或芳香族的。
[0017] 術(shù)語"烯"指不飽和的脂肪族（即，非芳族）非環(huán)烴，其可以為直鏈的或分枝的并 且包含至少一個(gè)（例如，一或二個(gè)）碳碳雙鍵然而其不包含任何碳碳三鍵。"C 2_8烯"指具 有2至8個(gè)碳原子的烯。此定義中也特別包括具有兩個(gè)碳碳雙鍵的烯（即，二烯），諸如， 例如，1，3- 丁二烯或異戊二烯。
[0018] 術(shù)語"烷基"指單價(jià)飽和的脂肪族非環(huán)烴基團(tuán)（即由碳原子和氫原子組成的基 團(tuán)），其可為直鏈的或分枝的并且不包含任何碳碳雙鍵或任何碳碳三鍵。
[0019] 術(shù)語"烯基"指單價(jià)不飽和的脂肪族非環(huán)烴基團(tuán)，其可為直鏈的或分枝的并且包含 至少一個(gè)碳碳雙鍵然而其不包含任何碳碳三鍵。
[0020] 在根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法中使用的生物特征還在于導(dǎo)致想要的產(chǎn)物的酶促途徑 包含蒸發(fā)到氣相中的中間物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)這意為在所選擇的發(fā)酵條件下中間物傾 向于穿過液相進(jìn)入氣相并因此在液相中酶促轉(zhuǎn)化不再能夠獲得顯著量。此類發(fā)酵條件優(yōu) 選地包括在液體，水性發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)生物。"水性的"優(yōu)選地意為發(fā)酵培養(yǎng)基含有至少 90vol. %水、更優(yōu)選至少95%和甚至更優(yōu)選100%作為溶劑。更優(yōu)選地以這樣的方式選擇 培養(yǎng)條件使得溫度在25°C和45°C之間、甚至更優(yōu)選在30°C和37°C之間，并且絕對(duì)壓力保持 在1巴和15巴之間、優(yōu)選地1. 2和5巴之間。
[0021 ] 在發(fā)酵過程中蒸發(fā)到氣相中的中間物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)稱為易揮發(fā)的。
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蒸發(fā)到氣相中的中間物意為中間物，當(dāng)作為純凈化合物和/ 或中間物的任何可能的化合物-水共沸物存在時(shí)，在1. 013巴時(shí)具有低于120°C的表觀沸點(diǎn) 或在25°C在水中無限稀釋時(shí)化合物的表觀蒸汽壓大于10毫巴，所述化合物的表觀蒸汽壓 定義為純組分蒸汽壓乘以無限水稀釋時(shí)水-中間物活度系數(shù)。
[0023] 甚至更優(yōu)選地，蒸發(fā)到氣相中的中間物意為中間物當(dāng)作為純凈化合物和/或中間 物的任何可能的化合物-水共沸物存在時(shí)，在1. 013巴時(shí)具有低于100 °C的表觀沸點(diǎn)或在 25°C在水中無限稀釋時(shí)化合物的表觀蒸汽壓大于50毫巴，所述化合物的表觀蒸汽壓定義 為純組分蒸汽壓乘以無限水稀釋時(shí)水-中間物活度系數(shù)。
[0024] 中間物可以為這樣的任何化合物，其作為通往想要的產(chǎn)物的酶促途徑中的中間物 出現(xiàn)并且在所選擇的發(fā)酵條件下蒸發(fā)到氣相中，并且因此在這些條件下其可以稱為易揮發(fā) 的。應(yīng)理解術(shù)語"中間物"也涵蓋如上所定義的和如下更詳細(xì)描述的兩種或多種中間物的 混合物。
[0025] 此類中間物的實(shí)例是氧化的有機(jī)化合物，特別是選自醛類、酮類和醇類的化合 物。優(yōu)選的實(shí)例選自乙醛、乙醇、丙酮、丙醛、丙-1-醇、丙-2-醇、丁醛、丁 -1-醇、丁酮、 丁 -2-醇、2-甲基-丙醛、2-甲基-丙-1-醇、2- 丁烯-1-醇（巴豆醇）、3_ 丁烯-2-醇、 3-甲基-2- 丁烯-1-醇（異戊烯醇）、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、3-甲基-3- 丁烯-1-醇（異 戊二烯醇）和3-甲基-3- 丁烯-2-醇。這些中間物的相關(guān)物理性質(zhì)示于圖3中。
[0026] 乙醛或乙醇可以例如，作為生產(chǎn)乙烯的中間物存在。
[0027] 丙酮、丙醛、丙-1-醇或丙-2-醇可以例如，作為生產(chǎn)丙烯的中間物存在。
[0028] 丁醛或丁-1-醇可以例如，作為生產(chǎn)丁-1-烯的中間物存在。
[0029] 丁酮或丁 -2-醇可以例如，作為生產(chǎn)丁 -1-烯或丁 -2-烯的中間物存在。
[0030] 丙酮、丙-2-醇、2-甲基-丙醛或2-甲基-丙-1-醇可以例如，作為生產(chǎn)異丁烯的 中間物存在。
[0031] 2-丁烯-1-醇（巴豆醇）或3-丁烯-2-醇可以例如，作為生產(chǎn)1，3-丁二烯的中 間物存在。
[0032] 3-甲基-2-丁烯-1-醇（異戊烯醇）、2_甲基-3-丁烯-2-醇、3-甲基-3-丁 烯-1-醇（異戊二烯醇）或3-甲基-3-丁烯-2-醇可以例如，作為生產(chǎn)異戊二烯的中間物 存在。
[0033] 例如，乙醛、乙醇、丙酮、丁醛和丁 -1-醇的生物學(xué)生產(chǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 (參見Gottschalk (1986)，Bacterial Metabolism,第 2 版，Springer-Verlag，New York) 并且存在豐富的優(yōu)化天然存在的生物的生物學(xué)生產(chǎn)上述物質(zhì)的信息。最近，已經(jīng)報(bào)道了使 用遺傳操縱以增加生產(chǎn)丙醛和丙-1-醇（Shen和Liao, Metab. Eng. 10(2008)，312-320)、 丙-2_ 醇（Hanai 等人，Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007) 7814-7818)、丁酮和丁 -2-醇 (US2009/0155870)、2-甲基-丙醛和 2-甲基-丙-1-醇（US 7, 993, 889)、2_ 丁烯-1-醇 (巴豆醇）（TO 2012/106516)和3-甲基-2-丁烯-1-醇（異戊烯醇）和3-甲基-3-丁 稀-卜醇（異戊二稀醇）（Withers 等人，Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007) 6277-6283 ; WO 2011/076261)〇
[0034] 已經(jīng)描述了使用水合酶的乙醇至乙烯、丙-1-醇和丙-2-醇至丙烯、丁 -1-醇至 丁 -1-烯、丁 -2-醇至丁 -1-烯和丁 -2-烯、2-甲基-丙-1-醇至異丁烯、2- 丁烯-1-醇（巴 豆醇）和3- 丁烯-2-醇至1，3- 丁二烯、和3-甲基-2- 丁烯-1-醇（異戊烯醇）和3-甲 基-3- 丁烯-1-醇（異戊二烯醇）至異戊二烯（2-甲基-1，3- 丁二烯）的酶催化的脫水。 特別地，描述了使用油酸水合酶（EC 4. 2. 1.53)或源自油酸水合酶的酶（WO 2011/076691) 或含異戊二烯基的異黃酮水合酶（例如kievitone水合酶（EC 4. 2. 1. 95)或phaseollidin 水合酶（EC 4. 2. 1.97)或源自含異戊二烯基的異黃酮水合酶的酶（W0 2011/076689和 W02011/076691)。已經(jīng)描述了利用巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶，和丁二烯合酶的 2_ 丁烯-1-醇（巴豆醇）酶促轉(zhuǎn)化為1，3- 丁二烯（W0 2012/106516)。
[0035] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，中間物對(duì)于用于根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法的生物是無毒的或 僅在非常高的濃度是有毒的。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的中間物的其他優(yōu)選的實(shí)施方案是丙酮。丙酮可以是由多種生 物天然生產(chǎn)的，包括來自梭菌屬、芽孢桿菌屬或假單胞菌屬的細(xì)菌，諸如丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)、解纖維素梭菌 (Clostridium cellulolyticum)、多粘氣芽抱桿菌（Bacillus polymyxa)或惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)。同時(shí)也報(bào)道了具有合成丙酮的能力的重組生物，例如經(jīng)遺傳修飾 的大腸桿菌細(xì)胞（Bermejo 等人，Appl. Environ. Microbiol. 64(1998) ;1079_1085 ;Hanai 等人，Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007)，7814-7818)。此外，已經(jīng)描述了人造的代謝途 徑，其利用丙酮作為中間物以生產(chǎn)目標(biāo)化合物。例如，W0 2011/032934描述了從丙酮和提 供活化的乙?；鶊F(tuán)的化合物生產(chǎn)3-羥基-3-甲基丁酸（也稱為0 -羥基異戊酸鹽或HIV) 的酶促方法。生產(chǎn)的3-羥基-3-甲基丁酸然后可以通過酶促催化的磷酸化/脫羧反應(yīng)進(jìn) 一步轉(zhuǎn)化為異丁烯（W0 2010/00