一種黃綠蜜環(huán)菌子實體核苷類化合物的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核苷類化合物的分離純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黃綠蜜環(huán)菌子實體 核苷類化合物的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 核苷是雜環(huán)堿基與糖縮合成的糖苷，包括糖上的Cl連接到雜環(huán)堿的氧原子或碳 原子上的化合物，由堿基和五碳糖(核糖或脫氧核糖)連接而成，即嘌呤的N-9或嘧啶的N-I 與核糖或脫氧核糖的C-I通過β糖苷鍵連接而成的化合物。核苷根據(jù)苷元連接糖種類不 同，分為核糖核苷和脫氧核糖核苷兩大類，其中核糖核苷是構(gòu)成RNA的核苷，主要分為四 種：腺苷、鳥苷、胞苷及尿苷；脫氧核糖核苷是構(gòu)成DNA的核苷，分為脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫 氧胞苷及脫氧胸腺苷。
[0003] 李子成及Dienstag J L等分別對核苷類化合物的生物活性進行了綜述及報道，研 宄表明核苷類化合物具有廣泛的藥理活性，可以作為藥物用于抗腫瘤、抗病毒等(李子成， 陳淑華，蔣寧等.核苷類抗病毒藥物的研宄進展，化學(xué)研宄與應(yīng)用，2002，14(1) :15-20; Dienstag J L， Benefits and risks of nucleoside analog therapy for hepatitis B， Hepatology, 2009, 49(5 Suppl): 112-121 ；Haubrich R Hj Riddler S A, DiRienzo A Gj et al. Metabolic outcomes in a randomized trial of nucleoside, nonnucleoside and protease inhibitor-sparing regimens for initial HIV treatment, Aids, 2009， 23(9): 1109-1118. )〇
[0004] 應(yīng)高山典型蕈菌現(xiàn)代研宄的需要，為了揭示大型蕈菌的物質(zhì)基礎(chǔ)及其核苷類化合 物的主要藥理活性，科研人員開展了有關(guān)核苷類化合物的分離純化工作。采用的方法主要 是使用95%乙醇或蒸餾水作提取溶劑，經(jīng)離子交換樹脂、大孔吸附樹脂及氧化鋁柱層析進 行前處理，最后用硅膠柱層析、薄層分離或制備色譜分離，得到單體，常用的洗脫劑有不同 比例的氯仿-甲醇-水混合溶劑和石油醚-乙酸乙酯體系。該方法主要存在以下問題：一、 核苷類化合物極性較強，在正相洗脫溶劑中溶解性差，導(dǎo)致其在硅膠柱分離時易產(chǎn)生拖尾 和死吸附等問題；二、大多數(shù)核苷類化合物在藥材中是微量成分，多次分離過程中由于死吸 附，容易造成原藥材中不存在該化合物的假象；三、大部分微量的核苷類化合物(或含正電 荷）聚類存在，在常規(guī)C18色譜柱上不成峰型，對其分離能力是一種挑戰(zhàn)；四、化合物制備可 控性差，無法實現(xiàn)有效的目標(biāo)制備，導(dǎo)致大量常量化合物的重復(fù)獲得，造成人力、物力的極 大浪費；五、色譜分離模式僵化，分離選擇性差，使得發(fā)現(xiàn)新化合物的困難越來越大。
[0005] 大型高山典型蕈菌中-蟲草屬（Cordyceps)、蜜環(huán)菌屬（Armillaria)和馬勃科中 已發(fā)現(xiàn)的核苷類化合物不超過20種。反相C18梯度洗脫是核苷類化合物的常用分析方 法，但很難使不同核苷類化合物達到基線分離。鑒于HILIC與RP分離機理完全不同。個 別研宄報道采用HILIC超高效液相色譜分離模式分析核苷類化合物，可以實現(xiàn)大部分化 合物的基線分離（Yao Xin, Zhou Guisheng, Tang Yuping, et al. HILIC-UPLC-MS/MS combined with hierarchical clustering analysis to rapidly analyze and evaluate nucleobases and nucleosides in Ginkgo biloba leaves, Drug testing and analysis, 2015，7(2): 150-157.)。因目前商品化的親水色譜分離材料種類很有限，將其用于核苷 類化合物的制備還鮮有報道。此外，有研宄報道采用高速逆流色譜（HSCCC)技術(shù)分離純 化核苷類化合物（Ling Jianya, Zhang Guoying, Lin Jianqun, et al. Supercritical fluid extraction of cordycepin and adenosine from Cordyceps kyushuensis and purification by high-speed counter-current chromatography, Separation and purification technology, 2009，66 (3) : 625-629.)，但該方法主要適用于分離純化一 些已知且高含量的化合物，而且合適萃取溶劑體系的選擇非常困難，萃取過程中易產(chǎn)生乳 化現(xiàn)象給分離檢測帶來不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、簡單的黃綠蜜環(huán)菌子實體核苷類化 合物的分離純化方法。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種黃綠蜜環(huán)菌子實體核苷類化合物的分離純化 方法，包括以下步驟： ⑴采用二維制備液相色譜系統(tǒng)，將黃綠蜜環(huán)菌子實體水提物經(jīng)第一維制備型高效 液相色譜分離，并按下述線性梯度洗脫方式進行洗脫：〇~1〇 min，體積濃度5% - 5%B ; 10~20 min，體積濃度 5% - 22%B ;20~25 min，體積濃度 22% - 95%B ;25~25 min，體積濃度 95% - 95%B ;收集餾分共計14個組分，每個組分減壓濃縮至恒重； ⑵在第一維制備所得14個組分中，核苷類化合物主要分布在餾分5~13共9個組分中； ⑶采用二維制備液相色譜系統(tǒng)，將所述餾分5~13共9個組分經(jīng)第二維制備型高效液相 色譜分離，即得核苷類化合物單體。
[0008] 所述步驟⑴中第一維制備型高效液相色譜分離的工作參數(shù)是指色譜柱為常用C18 反相色譜柱或耐純水C18反相色譜柱；制備流動相A水，B為甲醇、乙醇、乙腈中的一種；分 離過程中采用紫外檢測器檢測，檢測波長為254 nm;樣品溶液濃度為50.0 mg/mL~300.0 mg/mL，其采用體積濃度50%甲醇-50%水溶解；進樣體積為5. 0 mL。
[0009] 所述步驟⑶中第二維制備型高效液相色譜分離的工作參數(shù)是指色譜柱為親水 色譜柱，其內(nèi)徑為4.6 mm~100.0 mm;制備流動相為乙腈-水，其中乙腈的體積濃度為 40%~95% ;樣品溶液濃度為50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;進樣量為L 0 μ L~40.0 mL ;流速為 0. 5 ml ,/mi η ~480. 0 ml ,/mi η ;柱溫為 0~60°C。
[0010] 所述親水色譜柱是指硅膠柱、酰胺柱、兩性離子柱、二醇基柱中的任意一種。
[0011] 所述步驟⑴中減壓濃縮條件是指真空度為〇. 07~0. 09 MPa，溫度為60~70 °C。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點： 1、本發(fā)明采用二維制備液相色譜從黃綠蜜環(huán)菌水提取物中分離純化核苷單體，其中第 一維采用反相色譜柱、第二維采用親水色譜柱，無緩沖鹽添加，不但快速、簡單，而且便于樣 品制備后處理。
[0013] 2、采用本發(fā)明方法，可實現(xiàn)核苷類化合物的目標(biāo)制備，可獲取批量的已知活性核 苷，同時富集分離微量核苷，從而可以不斷豐富核苷類化合物庫，為核苷類化合物的活性研 宄和單一成分的新藥開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0014] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0015] 圖1為本發(fā)明的一維制備餾分收集色譜圖。
[0016] 圖2為本發(fā)明6個核苷類化合物單體的結(jié)構(gòu)信息。
【具體實施方式】
[0017] -種黃綠蜜環(huán)菌子實體核苷類化合物的分離純化方法，包括以下步驟： ⑴采用二維制備液相色譜系統(tǒng)，將黃綠蜜環(huán)菌子實體水提物經(jīng)第一維制備型高效 液相色譜分離，并按下述線性梯度洗脫方式進行洗脫：〇~1〇 min，體積濃度5% - 5%B ; 10~20 min，體積濃度 5% - 22%B ;20~25 min，體積濃度 22% - 95%B ;25~25 min，體積濃度 95% - 95%B ;收集餾分共計14個組分，每個組分減壓濃縮至恒重(參見圖1)。
[0018] 其中： 第一維制備型高效液相色譜分離的工作參數(shù)是指色譜柱為常用C18反相色譜柱或耐 純水C18反相色譜柱；制備流動相A水，B為甲醇、乙醇、乙腈中的一種；分離過程中采用紫 外檢測器檢測，檢測波長為254 nm;樣品溶液濃度為50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL，其采用體積 濃度50%甲醇-50%水溶解；進樣體積為5. 0 mL。
[0019] 減壓濃縮條件是指真空度為0· 07~0· 09 MPa，溫度為60~70 °C。
[0020] ⑵在第一維制備所得14個組分中，核苷類化合物主要分布在餾分5~13共9個組 分中。
[0021] ⑶采用二維制備液相色譜系統(tǒng)，將所述餾分5~13共9個組分經(jīng)第二維制備型高效 液相色譜分離，即得核苷類化合物單體。
[0022] 其中： 第二維制備型高效液相色譜分離的工作參數(shù)是指色譜柱為親水色譜柱，其內(nèi)徑為4. 6 mm~100. 0 mm ;制備流動相為乙腈-水，其中乙腈的體積濃度為40%~95% ;樣品溶液濃度為 50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;進樣量為 I