一種檢測宮頸癌標志物-foxp3自身抗體表位氨基酸序列及應用
【專利說明】-種檢測宮頸癌標志物-F0XP3自身抗體表位氨基酸序列 及應用
[0001]
技術領域
[0002] 本發(fā)明屬于免疫學技術領域，是一種用于制備宮頸癌早期診斷試劑和開發(fā)宮頸癌 治療靶向藥物的基礎。
【背景技術】
[0003] 宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅著婦女的健康。根據世界衛(wèi)生組 織的統(tǒng)計數(shù)據，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并成逐年增高和年輕化趨勢。每年宮頸癌的新發(fā)病 例有46. 6萬左右，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，死亡病例約有27萬。我國每年新發(fā) 病例約有10萬，占世界新發(fā)病例總數(shù)近20%，且近年來呈現(xiàn)地區(qū)增長及發(fā)病年齡提前的現(xiàn) 象，迫切需要識別和發(fā)現(xiàn)宮頸癌早期診斷的血清腫瘤標志物，以降低宮頸癌漏診率和死亡 率。
[0004] 大量研宄表明，血清或血漿中的腫瘤相關抗原能誘導機體產生抗原表位，在腫瘤 患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針對該腫瘤抗原的抗原表位。因此，既可以利用抗原 表位檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測腫瘤抗原表位，但利用腫瘤抗原表位檢測腫瘤的 特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關抗原不僅在腫瘤患者 體內存在，在正常人體內也存在，因此檢測腫瘤相關抗原作為診斷依據可信性差。而抗原表 位在正常人體內含量很低檢測不到或根本不存在，若體內抗原表位水平明顯增高，則表明 體內存在異常免疫情況，表明體內相關抗原水平發(fā)生波動，預示疾病的存在或原有疾病加 重。
[0005] 近年來的研宄表明，在惡性腫瘤體積發(fā)展到可用現(xiàn)代影像學技術檢出之前3-5 年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關抗原抗原表位。因此，檢測血中腫瘤相關抗原抗原表 位具有預測腫瘤發(fā)病風險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領域的重點發(fā)展方 向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的抗體 檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50%以上。其主要原因是由于每一種腫瘤 相關抗原抗原表位在患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏感度是當 前需要亟待解決的關鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當腫瘤標志物的抗原表 位，然后與現(xiàn)有已知的抗原表位組合成具有敏感度高和特異性強的診斷試劑盒。
[0006] 叉頭狀 / 翼狀螺旋轉錄因子 3 (forkhead or winged helix transcription， F0XP3)在組織間質中表達于T細胞核中，在癌細胞中表達于胞漿。人類的F0XP3基因位于 XplL 23,包含11個外顯子和10個內含子，cDNA全長為1869 bpi0XP3控制CD4+CD25+Treg 細胞的產生，并且決定其抑制功能。研宄表明無論是胸腺還是外周起源的調節(jié)性T細胞 (Treg)都能特異性地表達F0XP3,并主要表達在⑶4+⑶25+ Treg細胞上，是其最具特異性 的標志。Treg細胞的表達抑制其他T細胞的活化，阻礙機體對癌癥的免疫監(jiān)視，抑制腫瘤 細胞抗原的自身抗體發(fā)揮有效的免疫反應，以此給腫瘤提供免疫逃逸環(huán)境，促進腫瘤發(fā)生 發(fā)展。F0XP3還直接抑制T細胞的兩個關鍵轉錄因子一一活化T細胞核因子（NFAT)和核 因子κ B(NF-k B)的活性，二者是T細胞功能和細胞因子表達的決定因素。在癌組織中， F0XP3抑制體內的抗腫瘤免疫反應，使癌細胞發(fā)生腫瘤逃逸；另一方面F0XP3作為一種轉錄 因子，促進了腫瘤的浸潤進展和轉移。
[0007] 本發(fā)明通過自行設計的F0XP3的抗原多肽，檢測腫瘤患者血清及血漿中抗原表位 水平并開發(fā)相應的試劑，預測腫瘤發(fā)生的危險性，并為腫瘤新藥研宄提供可靠的數(shù)據。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術問題是公開一種腫瘤標志物F0XP3抗原表位。
[0009] 本發(fā)明同時公開了 F0XP3抗原表位的用途。
[0010] 本發(fā)明提供的一種檢測腫瘤標志物F0XP3抗原表位的氨基酸序列為： DRWAILEAPEKQRTLNEAVWTVDELEFRKKRSQ 純度 >95%, ρΗ>7· 0。
[0011] 本發(fā)明所述的F0XP3抗原多肽在制備預測宮頸癌早期診斷試劑盒中的應用。
[0012] 本發(fā)明利用自行設計的F0XP3蛋白的線性多肽，采用ELISA法檢測宮頸癌患者血 清及血漿中抗F0XP3蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤患者體 內F0XP3蛋白的表達量增加，預示患者可能出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤，可以預測宮頸癌發(fā) 生與復發(fā)的危險性，指導臨床醫(yī)生對宮頸癌的早期診斷。
[0013] F0XP3蛋白質氨基酸序列見Tab. 1
抗原抗體的結合實際上只發(fā)生在抗原決定簇和抗體的抗原結合位點之間，兩者在空間 結構和空間構型上完全互補。因此抗原決定簇就可以代表整個蛋白與抗體結合的狀態(tài)與親 和特性。另外，以重組蛋白為抗原，要經過載體構建、轉染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程， 蛋白空間結構復雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結合的特異性差。另外，ELISA法的 高靈敏性對純化技術的穩(wěn)定性要求極高，成本昂貴。
[0014] 發(fā)明人遵循以下原則設計線性多肽抗原：①選擇細胞膜蛋白表面區(qū)域；②選擇不 形成a-helix的序列；③兩端的肽段比中間的排列合理；④避免蛋白內部重復；⑤避免同源 性強的肽段；⑥序列中盡量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2個Pro利于肽鏈 結構穩(wěn)定，對產生特異性抗體有益。此外，該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原（HLA) 系統(tǒng)的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90%以上 華人群體的HLA二類抗原系統(tǒng)所識別。
[0015] 基于以上抗原設計原則及F0XP3蛋白的生物學特性，本發(fā)明利用生物信息學和多 個表位預測模擬軟件，分析與抗原性相關的參數(shù)，設計了的線性氨基酸序列(見Tab. 1)。加 框部分是多肽片段在蛋白質中的位置。
[0016] F0XP3: forkhead box P3 1-60 mpnprpgkps apslalgpsp gaspswraap kasdllgarg pggtfqgrdl rggahassss 61-120 lnpmppsqlq lstvdahart pvlqvhples pamisltppt tatgvfslka rpglppginv 121-180 aslewvsrep allctfpnps aprkdstlsa vpqssyplla ngvckwpgce kvfeepedfI 181-240 khcqadhlld ekgraqcllq remvqsleqq lvlekeklsa mqahlagkma ltkassvass 241-300 dkgsccivaa gsqgpvvpaw sgpreapdsl favrrhlwgs hgnstfpefI hnmdyfkfhn 301-360 mrppftyatl irwaileape kqrtlneiyh wftrmfaffr nhpatwknai rhnlslhkcf 361-396 vrvesekgav wtvdelefrk krsqrpsrcs nptpgp 由以上蛋白序列可知，F(xiàn)OXP3線性多肽