自組織化重組透明顫菌血紅蛋白及其基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種具有自組織化能力的重組透明顫菌 血紅蛋白及其基因在基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著細胞生物學以及生物工程技術在微生物、植物、動物領域的應用，利用基因工 程技術已經(jīng)可以生產(chǎn)、改良甚至構建具有目的功能或者生產(chǎn)目的基因工程產(chǎn)品，基因工程 產(chǎn)品的生產(chǎn)已經(jīng)取得了巨大的成功。
[0003] 基因工程技術結合對宿主細胞代謝合成途徑的認知，利用基因工程技術可以實現(xiàn) 宿主生物質(zhì)促進生產(chǎn)、目的基因工程產(chǎn)品促進生產(chǎn)、目的次級代謝產(chǎn)物促進生產(chǎn)。
[0004] 在基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)中，通過基因工程技術將目的基因與載體在體外連接后轉入 受體宿主細胞，使外源基因在宿主細胞中穩(wěn)定表達并遺傳。
[0005] 以抗生素等次級代謝產(chǎn)物為代表的基因工程產(chǎn)品在生產(chǎn)過程往往受到氧供給的 限制，氧需要通過溶解、傳遞等環(huán)節(jié)才能被宿主細胞利用，氧自身在水溶液中的溶解度有 限，為提高氧的供給能力，需要通過增加通氣量、加快攪拌速度等辦法來增加溶氧，這使得 基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)成為高能耗產(chǎn)業(yè)。隨基因工程技術的發(fā)展，利用基因工程技術改良宿主 氧獲得能力，降低基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)能耗，提高基因工程產(chǎn)品產(chǎn)量成為可能。目前，VHb已 經(jīng)應用于發(fā)酵、重組蛋白表達、次級代謝產(chǎn)品表達、轉基因動物、轉基因植物和環(huán)保領域，取 得了顯著成效。
[0006] 透明顫菌血紅蛋白（vitroeoscilla hemoglobin, VHb)是目前研宄較為深入的原 核生物血紅蛋白，VHb是由兩個相同亞基構成的同型二聚體蛋白，每個亞基含有146個氨基 酸殘基和一個b型血紅素分子。VHb具有很強的氧結合能力和非常迅速的氧釋放能力，在基 因工程產(chǎn)品生產(chǎn)中往往作為輔助蛋白使用，提高宿主菌的氧俘獲能力。
[0007] 在氧濃度較低（溶氧低于5%大氣飽和度）的情況下，VHb受到其天然啟動子的誘 導表達，研宄表明，當VHb在宿主細胞中表達時，宿主細胞的tRNAs和核糖體含量有所提高， 宿主細胞的呼吸活性和ATP含量也有所增加。Khosla等（Nature, 1988, 331，633-635)提 出，在低氧條件下，VHb血紅蛋白能夠大量積累，一部分VHb以活性的氧合蛋白形式存在，加 速氧在低氧條件下向胞內(nèi)傳遞，構造一個有機體可直接利用的蓄氧倉庫，氧合血紅蛋白能 提高氧在呼吸鏈上的傳遞效率，加快了質(zhì)子傳遞，促進了 ATP的合成，提高了整個能量代謝 水平。
[0008] Ramande?。↗. Biol. Chem. 2001，276, 24781 - 24789)研宄表明 VHb 在大腸桿菌中 表達時存在質(zhì)膜結合和胞質(zhì)表達兩種模式，Rinaldi指出質(zhì)膜結合形式的VHb起到氧俘獲 功能（Biochemistry 2006, 45, 4069-4076)，Anand指出胞質(zhì)表達VHb起到氧感受器的功能， 感受宿主細胞內(nèi)的氧化壓力，當宿主細胞內(nèi)氧化壓力增加時抑制VHb蛋白的表達（Biochem J. 2010, 426, 271-280)。相比而言，質(zhì)膜結合型的VHb對宿主細胞的氧供給能力有著更為重 要的作用。
[0009] 為提高VHb對宿主細胞的促進效果，對VHb的密碼子偏好性改造、定點突變、 易錯PCR(error-prone PCR)改造、DNA改組（DNA shuffling)改造已經(jīng)廣泛展開，這些 工作的進行進一步加深了對VHb生物工程和結構關系的理解，I sarankura-Na-Ayudhya 指出對VHb自身結構的改造會引發(fā)該蛋白功能的較大變化（J microbiol biotechnol 2010, 20, 532-541 ;J.Biosci. Bioeng. 2010，110, 633-637 ;Int J biol Sci. 2008, 4, 71-80)。
[0010] 這種情況下，在保留VHb自身結構穩(wěn)定的前提下，在VHb功能結構域之外引入自組 織化多肽序列構建新的重組蛋白，利用自組織化片段間的相互識別和相互作用，改變重組 蛋白的組裝和宿主細胞內(nèi)的分布形式，進而影響宿主的氧俘獲和氧儲存能力就成為一種新 的VHb蛋白結構改造方法。
[0011]自組織化是蛋白質(zhì)的一種特殊的組裝方式，自組織化是通過多肽序列間直接的弱 相互作用進行識別和組裝的，自組織化后的蛋白質(zhì)自組裝體呈現(xiàn)出較強的質(zhì)膜結合能力。 自組織化多肽序列可以通過基因工程技術拼接到不同的重組蛋白內(nèi)，誘導重組蛋白實現(xiàn)自 組織化。至今未見利用自組織化片段重組技術，改進重組透明顫菌血紅蛋白的質(zhì)膜結合能 力的研宄

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為提高宿主細胞中質(zhì)膜結合型VHb含量，本發(fā)明提供一種具有自組織化能力的重 組透明顫菌血紅蛋白，該蛋白在宿主細胞內(nèi)依據(jù)自身結構和蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，提高質(zhì)膜 結合型VHb含量，增加宿主細胞從環(huán)境中獲得氧的能力，改善宿主細胞的氧俘獲能力。
[0013] 本發(fā)明所述的自組織化重組透明顫菌血紅蛋白是以連接肽模塊連接透明顫菌血 紅蛋白模塊和自組織化模塊；自組織化模塊誘導重組蛋白在宿主細胞內(nèi)形成自組裝體，自 組裝體蛋白依據(jù)其自身的質(zhì)膜結合能力與宿主細胞質(zhì)膜進行結合，透明顫菌血紅蛋白模塊 在宿主細胞質(zhì)膜附近起到從宿主細胞生存環(huán)境中俘獲氧的功能。本發(fā)明可以用于改進宿主 細胞從環(huán)境中獲得氧的能力，有助于促進基因工程產(chǎn)品的表達，降低基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的 能耗（實施例1中有體現(xiàn)（圖10)，相同轉速條件下，含有自組織化重組透明顫菌血紅蛋白 的宿主細胞發(fā)酵液中溶氧值高于陰性對照組（僅表達GFPuv的宿主細胞），在停止外界供氧 的條件下，含有自組織化重組透明顫菌血紅蛋白的宿主細胞的發(fā)酵液中氧濃度降低緩慢， 而陰性對照組氧迅速的消耗殆盡，這說明我們的基因產(chǎn)物自組織化透明顫菌血紅蛋白可以 實現(xiàn)氧儲存和氧緩釋，有效的緩解發(fā)酵液發(fā)酵罐中的氧不足，一般說來，只要降低了發(fā)酵過 程中向發(fā)酵液（罐）中補充氧或者空氣的量（頻率），或者提高了發(fā)酵液中細胞環(huán)境的溶氧 度，就會降低基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的能耗，為了保持發(fā)酵過程中發(fā)酵液中細胞周圍的氧濃度， 向發(fā)酵罐中補充氧氣或者空氣的能耗很高）。
[0014] 與【背景技術】相比：
[0015] 1)利用連接肽模塊分割了自組織化模塊與透明顫菌血紅蛋白模塊，連接肽模塊的 存在，保證了重組蛋白中各個功能模塊在蛋白質(zhì)折疊過程中以自身固有的折疊及組裝規(guī)律 進行二級、三級結構的實現(xiàn)，以單獨的結構域存在在多模塊重組蛋白中，連接肽模塊在不影 響透明顫菌血紅蛋白氧結合-釋放能力的前提下，賦予重組蛋白自組織化功能；
[0016] 2)利用透明顫菌血紅蛋白模塊實現(xiàn)重組透明顫菌血紅蛋白的氧結合和釋放功能， 保留了對透明顫菌血紅蛋白進行進一步的密碼子代換、突變、易錯PCR改進和DNA重組改進 的可能，即該重組蛋白保留了隨技術進步再次進行優(yōu)化和改造的能力；
[0017] 3)利用自組織化模塊實現(xiàn)了重組透明顫菌血紅蛋白在宿主細胞內(nèi)的自組織化和 質(zhì)膜結合定位，改進了宿主細胞的氧俘獲功能。
[0018] 4)自組織化重組透明顫菌血紅蛋白基因在透明顫菌血紅蛋白基因自身的厭氧啟 動子控制下，可以通過本領域中為人所熟知的知識和技術引入不同的基因載體和宿主細胞 中，進行基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)。
[0019] 如圖1所示，本發(fā)明所述的自組織化重組透明顫菌血紅蛋白是由透明顫菌血紅蛋 白模塊、連接肽模塊和自組織化模塊組成，其中連接肽模塊數(shù)目可有操作人員依據(jù)具體需 求進行靈活調(diào)整；自組織化模塊分為強質(zhì)膜結合（膜破壞）模塊和強質(zhì)膜結合（膜穩(wěn)定） 模塊，本發(fā)明中，膜破壞不是殺傷性的破壞細胞膜，而是讓細胞膜不穩(wěn)定，使細胞內(nèi)的基因 工程產(chǎn)品向發(fā)酵液中泄露，這種泄露并不影響四百的存活和基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)，本發(fā)明 中強質(zhì)膜結合（膜破壞）模塊可以替代基因工程蛋白產(chǎn)物分泌型表達時常采用的信號肽序 列，操作人員可以根據(jù)具體需求進行靈活選擇。
[0020] 其