一種中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新的抗A型H7N9流感的血凝素 HA蛋白的抗體系列及其人源化抗體， 該類抗體可在較小的劑量下中和IOOTCID5ci的H7N9病毒到半數(shù)感染MDCK細胞，并且針對 10LD50劑量下保護小鼠，達到90%的死亡保護率，因而該抗體可用于針對H7N9病毒所引發(fā) 疾病的治療和預防。本發(fā)明還涉及抗體結(jié)合的H7N9血凝素蛋白的結(jié)合表位及其抗體所結(jié) 合的氨基酸。本發(fā)明還涉及采用基因重組技術(shù)在CHO細胞中生產(chǎn)該抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒通過血凝素（HA)的類型定義為A和B兩種類型，A型可細分為16種亞型， 其中組 I 有 Hl，H2, H5, H6, H8, H9, HI1，H12, H13 和 H16 亞型存在，組 II 由 H3, H4, H7, H10， H14和H15亞型組成。B型和A型中的Hl，H2和H3在人類中引發(fā)較廣泛的流感疾病，H5，H7和 H9亞型在人類中引起散發(fā)性嚴重感染并可能引起新的大流行病。2013年的2月到6月，在 中國爆發(fā)了高致病性和高死亡率的人感染甲型H7N9流感病毒，共132人感染，其中43人死 亡【Rongbao G等人.N Engl J Med. 2013,368:1888-1897】。該病毒由在人類中散發(fā)的!17和 N9亞型的病毒重配而成，人體中沒有建立相應的免疫反應記憶，因此該病毒感染可引發(fā)劇 烈的呼吸道窘迫綜合征，導致病人死亡【Kageyama T等人，Euro SUrvell. 2013. 18 :20453】。 人季節(jié)性流感疫苗由A-HlNl，A-H3N2和B型3種亞型組成，人體對該類疫苗建立的免疫應 答對H7N9病毒沒有保護作用。因此H7N9病人感染后，急需外源的抗病毒藥物來抑制病毒在 體內(nèi)的擴增。盡管，目前還沒有人之間H7N9感染的傳播，但已有多個實驗表明，在流感敏感 性動物如雪貂、豬之間可以發(fā)生非接觸性的空氣傳播【Herfst S，等人，Science. 2012 ;336 : 1534-41 ;H. Zhu 等人，Science. 2013. 341(6142) :183-186】。秋冬季為流感的高發(fā)季節(jié)，我 們需要有效的藥物來控制和治療可能發(fā)生的新的H7N9流感病例的出現(xiàn)。
[0003] 當前，對H7N9病毒抑制藥物為達菲（Oseltamivir)或其類似物（Zanamivir)，該小 分子藥物為流感病毒NA蛋白的酶活性抑制劑，它們的效果是避免或減少病毒的擴增，從而 達到降低病毒滴度的治療效果。該藥物在臨床上有一定的效果，但其病毒清除的速率還是 比較慢，并且已有出現(xiàn)達菲耐受株的報道，因此需要有更理想的藥物來快速降低病毒在體 內(nèi)的復制【Yunwen Hu 等人，Lancet. 2013. 381 :2273-79】。
[0004] 有報道用康復病人的血清救活了流感危重病人，因此中和抗體也是正在熱點研發(fā) 的可用于預防和治療的抗病毒藥物。血凝素蛋白（HA)是廣譜和亞型特異抗體的首要目標， 該蛋白是由HAl和HA2亞基組成包含500多個氨基酸的三聚體蛋白ΗΑ0。其HAl頭部是 病毒與靶細胞的唾液酸受體結(jié)合的部位，可使病毒與細胞黏附，低pH值的環(huán)境可引發(fā)莖部 HA2區(qū)域的構(gòu)象變化可使病毒與細胞膜融合，當病毒內(nèi)吞到細胞內(nèi)部后，病毒的基因組被釋 放到細胞質(zhì)中，新的病毒可以在細胞內(nèi)復制。針對HA的抗體可以有效的阻止病毒感染細胞 的過程，從而中斷病毒復制鏈。在不同的亞型中，與流感受體唾液酸結(jié)合的HAl的區(qū)域差異 較大，并且同一亞型在HAl區(qū)域也會不斷進化出新的變體，因此，該位點雖不具有廣譜性， 但為最有效的中和位點【Kida H等人，Vaccine. 1985,3,219-222】。目前的廣譜抗體主要針 對相對保守的HA2區(qū)域，該類抗體結(jié)合HA2表位后，可通過空間位阻來阻止HA蛋白的變構(gòu) 來阻斷病毒的感染過程。M2蛋白的抗體也有報道顯示具有體內(nèi)的保護效果，M2為病毒表面 的離子通道蛋白，在病毒或細胞表面只有24個氨基酸，當病毒感染細胞后，該細胞表面抗 原表達大量的M2蛋白?？筂2的抗體可以結(jié)合病毒復制細胞，通過ADCC和⑶C的機理來殺 死該細胞，起到病毒抑制效果。目前已有多種不同類型的抗血凝素和抗M2的抗體在研發(fā)階 段，少量的抗體已進入臨床I和II期研究，目前還沒有上市的抗體藥物。
[0005] 盡管經(jīng)過了數(shù)十年的研究，針對突發(fā)事件，比如H7N9病毒爆發(fā)事件，快速的找出 最有效的應急藥物仍是非常緊要和挑戰(zhàn)的任務，因此需要通過多種渠道（化藥、中藥和生 物藥）找出最有效的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明主要涉及一種結(jié)合人感染甲型H7N9流感病毒血凝素蛋白的抗體及其抗原 結(jié)合片段，該抗體是從 H7N7A/Netherlands/219/2003 和 H7N9 (A/Anhui/1/2013)血凝素蛋 白HA免疫的兔脾和骨髓組織構(gòu)建的抗體庫中用H7N9(A/Anhui/1/2013)的血凝素蛋白篩選 獲得，該抗體的結(jié)合表位為HAl表面與唾液酸結(jié)合的區(qū)域。因此，本發(fā)明包含了中和人感染 甲型H7N9和相關(guān)H7甲型流感病毒感染的抗體及其抗原結(jié)合片段。
[0007] 在本發(fā)明的一個具體實例中，本發(fā)明包含一個中和人感染H7N9流感病毒的抗體 和其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的另一個實施例中，本發(fā)明包括一種抗體或其抗原結(jié)合片段， 其包含至少一個互補決定區(qū)（⑶R)序列，該序列與SEQ ID NO :2, 8, 13,15,18和19中的任 一個有至少61%的序列同源性。其中所述抗體中和人感染H7N9甲型流感病毒。
[0008] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，本發(fā)明所包含的抗體及其抗原結(jié)合片段中，包括 具有SEQ ID NO : 1-6的氨基酸序列的輕鏈CDRl，具有SEQ ID NO :7-10的氨基酸序列的輕 鏈⑶R2和具有SEQ ID NO :11-14的氨基酸序列的輕鏈⑶R3,其中所述抗體中和甲型流感病 毒。在本發(fā)明的另一個實施例中，本發(fā)明所包含的抗體及其抗原結(jié)合片段中，包括具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的重鏈CDRl，具有SEQ ID NO :16-18的氨基酸序列的重鏈CDR2和 具有SEQ ID NO :19的重鏈⑶R3,其中所述抗體中和人感染H7N9甲型流感病毒。
[0009] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，本發(fā)明所包含的抗體及其抗原結(jié)合片段中，輕鏈 ⑶Rl的同源性范圍為61% -100%，輕鏈⑶R2的同源性范圍為62%-100%，輕鏈⑶R3的同 源性范圍為80% -100%。在本發(fā)明的另一個實施例中，重鏈⑶Rl的同源性范圍為100%， 重鏈⑶R2的同源性范圍為87% -100%，重鏈⑶R3的同源性范圍為100%。其中所述抗體 中和人感染H7N9甲型流感病毒。
[0010] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，本發(fā)明包含一種抗體及其抗原結(jié)合片段，其中所 述抗體包含含SEQ ID NO :20氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :29氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :21氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :30 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :22氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO :31氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :23氨基酸序列 的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :32氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO: 24氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :33氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含 含SEQ ID NO :25氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :34氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或 所述抗體包含含SEQ ID NO :26氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :35氨基酸序列的 重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :27氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :36 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :28氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO :37氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；并且其中所述抗體中和人感染H7N9甲型流感病 毒，是 H7N9-R002 和其變異體 H7N9-R003, H7N9-R006, H7N9-R019, H7N9-R031，H7N9-RA401， H7N9-RA403, H7N9-RA595, H7N9-R021。
[0011] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，本發(fā)明包含一種抗體及其抗原結(jié)合片段，其中所 述抗體包含含SEQ ID NO :38核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :39核苷酸序列的重 鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :40核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :41 核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :42核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO :43核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :44核苷酸序列 的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :45核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO: 46核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :47核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含 含SEQ ID NO :48核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :49核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；或 所述抗體包含含SEQ ID NO :50核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :51核苷酸序列的 重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :52核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :53 核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；或所述抗體包含含SEQ ID NO :54核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO :55核苷酸序列的重鏈可變區(qū)；并且其中所述抗體中和人感染H7N9甲型流感病 毒，是 H7N9-R002 和其變異體 H7N9-R003, H7N9-R006, H7N9-R019, H7N9-R031，H7N9-RA401， H7N9-RA403, H7N9-RA595, H7N9-R021。
[0012] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明包含一種抗