一種耐有機(jī)溶劑半乳糖苷酶高產(chǎn)菌以及該半乳糖苷酶的基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐有機(jī)溶劑半乳糖苷酶高產(chǎn)菌，其耐有機(jī)溶劑半乳糖苷酶，以及 一種以乳糖為供體酶法半乳糖基化核苷類化合物的方法，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 疊氮胸苷、阿昔洛韋等核苷類藥物是一類重要的抗腫瘤、抗病毒藥物，廣泛應(yīng)用于 臨床治療各種癌癥。疊氮胸苷是第一個(gè)抗HIV病毒藥物，阿昔洛韋則是目前臨床上最有效 的抗I型和II型單純皰瘆病毒之一，對(duì)急性視網(wǎng)膜壞死水痘帶狀皰瘆病毒和EB病毒等其 他皰瘆病毒也有療效。然而，疊氮胸苷由于高血漿濃度而引發(fā)較強(qiáng)的毒副作用，阿昔洛韋則 會(huì)對(duì)血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有一定的毒副作用。為了獲得最佳治療效果和較小 毒副作用，可以對(duì)疊氮胸苷等核苷類藥物進(jìn)行糖基化修飾。糖基化是一類重要的改性修飾 反應(yīng)，不僅會(huì)改變化合物的生物活性、水溶性、穩(wěn)定性、在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸特性、亞細(xì)胞定位以 及特異性傳遞等特性，另外還能降低化合物的毒性。研宄表明（Abram R.，Aman N.，von Borstel R.，Cell Biophysics, 1994，24-25 (I) :127-133) 5-氟尿苷的半乳糖衍 生物（5' -半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母藥5-氟尿苷低100倍。Bonina等 (Bonina, F. , Puglia, C. ; Rimoli, M. G. ; Aval lone, L. , Abignente, E. ; Boatto, G. ; Nieddu, Μ. ; Meli, R. ; Amorena Μ. ; de Caprariis, Ρ. Eur. J. Pharm. Sci., 2002，16(3): 167-174)也報(bào)道了疊氮胸苷的半乳糖基衍生物不僅可以降低疊氮胸苷的血 漿濃度，而且可以保持有效濃度更長(zhǎng)時(shí)間，避免頻繁給藥。
[0003] 目前，核苷糖基化衍生物主要通過化學(xué)法合成，但由于兩底物中均存在多個(gè)活 性羥基或氨基，化學(xué)法的選擇性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保護(hù)/脫保 護(hù)步驟，工藝非常復(fù)雜。而酶法糖基化一般只需一步反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，具有很高的 區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性。然而，有關(guān)用糖苷酶催化核苷糖基化反應(yīng)的報(bào)道并不多。 Binder 等(Binder ff.H. , Kiihlig Η. , Schmid ff. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)催化底物對(duì)硝基 苯基-β-D-半乳糖苷（/7NPG)和四種天然核苷（2' -脫氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成 了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率僅為3-7 %，區(qū)域選擇性很差。Andreotti 等（Andreotti G. , Trincone A. , Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007，47(1-2) :8-32)利用來源于海洋軟體動(dòng)物黑指紋海兔胰腺的β-半乳 糖苷酶，以鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷（〇NPG)為糖基供體，催化疊氮胸苷半乳糖基化生成 5'-仏β-半乳糖基-疊氮胸苷，產(chǎn)率達(dá)到了 43 %，但其對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率僅為21. 5 %。顏麗 強(qiáng)等人（Yan L Q, Li Ν, Zong M Η. Journal of Biotechnology, 2012，164(2):371-375) 利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG為供體進(jìn)行了阿昔洛韋等無環(huán)核苷的半乳糖基化反應(yīng)，但 是對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率僅有13 %，而且底物濃度僅為0.01 M。
[0004] 雖然說在過去幾年中生物法糖基化修飾核苷類藥物取得了一定的突破與進(jìn)展，但 仍存在一些問題亟需解決。目前酶法糖基化修飾核苷類藥物的糖基供體主要是oNPG或者 是/7NPG，這些相比較于寡糖來說，其價(jià)格昂貴，實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值較低。而通常的酶法催化在 水中進(jìn)行，而要修飾阿昔洛韋等不溶于水或者難溶于水的化合物時(shí)，低產(chǎn)率及低轉(zhuǎn)化率也 成為糖基化修飾的另一瓶頸。近年來不斷發(fā)展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差 的問題，還可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的調(diào)控，如果再以寡糖為糖基供體，將能很好地克服目 前生物法糖基化修飾核苷類藥物存在的問題。因此，篩選以寡糖為糖基供體在非水相中糖 基化修飾核苷類藥物的半乳糖苷酶具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的針對(duì)目前糖基化修飾核苷類藥物存在的糖基供體價(jià)格昂貴、糖基化 反應(yīng)轉(zhuǎn)化前底物濃度低、產(chǎn)物摩爾轉(zhuǎn)化率也較低等問題，提供一種有機(jī)溶劑耐受性好、以乳 糖為糖基供體的β -半乳糖苷酶及其產(chǎn)生菌，含有編碼該酶基因的重組表達(dá)載體、重組表 達(dá)轉(zhuǎn)化體及其高效制備方法，以及一種以乳糖為供體酶法半乳糖基化核苷類化合物的方 法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先從本實(shí)驗(yàn)室耐有機(jī)溶劑菌庫中篩選獲得一株 耐有機(jī)溶劑β -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，分類命名為干酪乳桿菌YZ09(L3cic^aciT7w5· casei YZ09)，其保藏編號(hào)為 CCTCC :M 2014540。
[0007] 本發(fā)明對(duì)干酪乳桿菌casei YZ09的生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定，該菌株 為革蘭氏陽性菌株，無芽孢的桿菌，兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為30~40°C。其生理生化特性 表現(xiàn)在：過氧化氫酶反應(yīng)結(jié)果為陰性，明膠反應(yīng)結(jié)果為陰性，無運(yùn)動(dòng)，氧化葡萄糖產(chǎn)酸，可利 用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麥芽糖、甘露醇等。
[0008] 經(jīng)16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為ZacioAaciBw1S casei。
[0009] 本發(fā)明對(duì)該耐有機(jī)溶劑半乳糖苷酶產(chǎn)生菌YZ09進(jìn)行了產(chǎn)酶優(yōu)化，優(yōu)化后產(chǎn)酶量 達(dá)到了 6. 58 U/mL 本發(fā)明分離克隆到c<asi?iYZ09菌株所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑半乳糖苷酶GAL的 編碼基因，它具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá) 系統(tǒng)中高效表達(dá)提供了優(yōu)良的基因材料。通過PCR法分離克隆了這一耐有機(jī)溶劑半乳糖苷 酶GAL基因，DNA全序列分析結(jié)果表明，該耐有機(jī)溶劑糖苷酶GAL基因全長(zhǎng)1797個(gè)核苷酸， 編碼598個(gè)氨基酸。
[0010] 本發(fā)明構(gòu)建了耐有機(jī)溶劑半乳糖苷酶GAL基因的表達(dá)載體。它可以通過本領(lǐng)域常 規(guī)方法將本發(fā)明所述基因連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種 載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、菌體或病毒載體等，優(yōu)選pET28a。較佳的，可通過下述方法制 得本發(fā)明的重組表達(dá)載體：將通過PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I 進(jìn)行雙酶切，形成互補(bǔ)的粘性末端，同時(shí)將載體pET28a用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I 雙酶切，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，形成含有本發(fā)明的β-半乳糖苷酶基因的重組表達(dá)載體 ρΕ?-galo
[0011] 本發(fā)明將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞制得重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。所述的宿主可 為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主，只要能滿足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā) 明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表發(fā)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸埃希氏菌 (萬.co7i) JM109 (DE3)。將前述重組表達(dá)質(zhì)粒pET-^a7轉(zhuǎn)化至（萬.co7i) JM109 (DE3)中， 即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即大腸埃希氏菌（萬.cWi) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0012] 本發(fā)明還提供一種重組β-半乳糖苷酶的制備方法，其包括如下步驟：培養(yǎng)本發(fā) 明前述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組表達(dá)的β_半乳糖苷酶。其中，所述的培養(yǎng)重組表達(dá) 轉(zhuǎn)化體中所用的培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域常規(guī)的任何可使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明的β-半乳 糖苷酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7. 0。培 養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不同按本領(lǐng)域 普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要是轉(zhuǎn)化體能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明所述的β -半乳糖苷酶即 可。其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，優(yōu)選下述方法：將本發(fā)明涉及 的重組大腸桿菌JM109 (DE3) /pET-gW接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的 光密度〇D_達(dá)到0. 6-1. 0時(shí)，在終濃度為0. 1-1. 0 mmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳 糖苷（IPTG)的誘導(dǎo)下，高效表達(dá)本發(fā)明的重組β-半乳糖苷酶。
[0013] 本發(fā)明中催化乳糖和核苷類藥物轉(zhuǎn)糖基得到半乳糖基核苷類衍生物的催化劑，可 以是上述產(chǎn)生的重組β -半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，也可以是通過將培養(yǎng)基離心分離 后得到的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。
[0014] 另一方面，本發(fā)明提供一種以乳糖為供體酶法半乳糖基化核苷類化合物的方法。 該方法包括將具有本發(fā)明半乳糖基化酶活力的物質(zhì)加入含有核苷類化合物的轉(zhuǎn)化夜中，進(jìn) 行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使核苷類化合物轉(zhuǎn)化為半乳糖基核苷類衍生物，所述轉(zhuǎn)化液中含有核苷 類化合物和糖基供體，所述核苷類化合物為疊氮胸苷、阿昔洛韋，所述糖基供體為乳糖。
[0015] 優(yōu)選地，所述具有半乳糖基化酶活力物質(zhì)包括具有半乳糖基化酶活力的發(fā)酵液、 發(fā)酵液上清、純化的半乳糖基化酶和半乳糖基化酶重組表達(dá)蛋白。
[0016] 優(yōu)選地，所述半乳糖基化酶為半乳糖苷酶，更優(yōu)選地，所述半乳糖苷酶為 本發(fā)明中菌株ΥΖ09所產(chǎn)β-半乳糖苷酶或其重組表達(dá)蛋白。
[0017] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)在非水