一種冷凍保存的雜交鲆精子與牙鲆卵子的回交人工授精的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種冷凍保存的雜交鲆精子與牙鲆卵子的回交人工授精的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雜交育種是比較容易實(shí)施也容易見效的一種育種方法，它利用現(xiàn)有的品種或物種進(jìn)行雜交，從其后代選育出符合人們需要的基因組合。選擇地理遠(yuǎn)緣的物種作為雜交親本，可以增加雜交子代的多態(tài)性，易于從它們的雜交后代出現(xiàn)多種多樣類型，比較容易從中獲得符合要求的新類型。牙鮮(Paralichthys olivaceus)和雜交鮮(Paralichthysdentatus)是重要的海水養(yǎng)殖魚種，分別分布于太平洋和大西洋沿岸，雖然屬同一屬，但地理分布距離較遠(yuǎn)。牙鲆(罕)與雜交鲆(? )作為親本，通過(guò)人工授精方法，獲得發(fā)育、生長(zhǎng)正常的雜交子代。雜交子代經(jīng)過(guò)三年培育，人工性腺發(fā)育成熟誘導(dǎo)，獲得成熟精液，然后與牙鲆進(jìn)行回交受精，回交子代具備本地牙鲆仔、稚、幼魚期生長(zhǎng)快，又具備幼魚期后耐高溫的特點(diǎn)。因此回交子代在養(yǎng)殖過(guò)程中表現(xiàn)出生長(zhǎng)快、溫度適應(yīng)范圍廣，特別是耐高溫等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種冷凍保存的雜交鲆精子與牙鲆卵子的回交人工授精的方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種冷凍保存的雜交鲆精子與牙鲆卵子的回交人工授精的方法，將采集的雜交鲆精子經(jīng)超低溫冷凍保存，然后將長(zhǎng)期超低溫冷凍保存的雜交鲆精子經(jīng)二步水浴解凍，溶解后加入雜交鲆凍精3-5倍體積的稀釋液，離心收集沉淀，而后將沉淀與牙鲆卵子進(jìn)行人工授精；其中，稀釋液為NaCl 7g/L和KH2PO4L Og/L和水組成。
[0006]采集繁殖期精子活力85%以上的雜交鲆精子將其與抗凍液按體積比為1:2 — I:3的比例在碎冰中輕輕震蕩、充分混勻平衡5-6min ;而后以-10 °C —-20 V /min的降溫速率降溫至_80°C，然后再以_30°C /min降溫速率降至_150°C，置于液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期超低溫冷凍保存，得到長(zhǎng)期超低溫冷凍保存的雜交鲆精子。
[0007]所述抗凍液由抗凍劑和稀釋液和添加劑組成；其中稀釋液由NaCl和KH2PO4和水組成；抗凍劑為丙二醇(PG);添加劑為葡萄糖和海藻糖；抗凍液為NaCl 7g/L、KH2PO4L Og/L,葡萄糖10g/L、海藻糖10g/L，水IL以及上述各成分體積的9-13%的丙二醇(PG)。
[0008]所述二步水浴解是將長(zhǎng)期超低溫冷凍保存的雜交鲆精子先置于35-37?水浴鍋中輕輕搖動(dòng)90s，然后置于18-20°C的室溫下輕輕搖動(dòng)30s，實(shí)現(xiàn)二步水浴解，融解后置于0-4 °C的冰盒中保存。
[0009]將經(jīng)二步水浴解凍后雜交鲆凍精與稀釋液按體積比1:3-5的比例混合，混合后以300g的離心力離心5min-8min，然后去掉上清液，獲得與稀釋前同樣體積的凍精懸液，放置于0-4°C冰盒，待用。
[0010]將上述所得凍精懸液與自然海水按體積比為1:40的比例混勻進(jìn)行激活，激活后注入牙鲆卵子中，輕輕混勻，使牙鲆卵子與雜交鲆凍精充分接觸，靜置5-10min ;然后洗卵，用篩絹網(wǎng)過(guò)濾，將收集的受精卵放置于新鮮的海水中沖洗3?5次，沖洗后靜置，取上浮卵進(jìn)行孵化。
[0011]本發(fā)明所具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0012]1.本發(fā)明采集性成熟雜交鲆雄魚優(yōu)質(zhì)精子經(jīng)過(guò)超低溫冷凍保存，然后獲得與其同步的牙鲆卵子進(jìn)行回交進(jìn)而實(shí)現(xiàn)人工授精。其中，雜交鲆精子的超低溫冷凍保存技術(shù)可以長(zhǎng)期保存雜交鲆凍精，隨時(shí)、隨地可以解凍應(yīng)用。
[0013]2.本發(fā)明超低溫冷凍保存雜交鲆精子時(shí)以9-13%丙二醇(PG)為滲透性抗凍劑，葡萄糖和海藻糖各10g/L作為費(fèi)滲透性抗凍劑，增加對(duì)凍精的保護(hù)效果且有效的降低毒性。
[0014]3.本發(fā)明超低溫冷凍保存雜交鲆精子解凍過(guò)程中采用35-37°C和18°C _20°C二步水浴解凍，避免了凍存管周圍溫度過(guò)高對(duì)凍精造成的損傷。
[0015]4.本發(fā)明凍精在用于人工授精前采用3倍體積稀釋液稀釋，300g的離心力離心洗脫，減少抗凍劑的毒性對(duì)凍精質(zhì)量的影響同時(shí)不破壞精子的結(jié)構(gòu)。
[0016]5.本發(fā)明人工授精過(guò)程中首先采用一定量海水將凍精激活然后倒入卵子中，海水在激活凍精的同時(shí)又可進(jìn)一步洗脫抗凍劑對(duì)精子活力的影響；
[0017]6.本發(fā)明人工授精的重復(fù)性穩(wěn)定性好，好凍精解凍后復(fù)蘇率高，激活后運(yùn)動(dòng)率70-80 %，受精率在80-90 %，孵化率80-90 %。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
[0019]2014年3月，采集正值雜交鲆生殖盛期的精子，即于日照養(yǎng)殖場(chǎng)魚培育車間采集雜交鲆精子，并存于干凈的離心管中，顯微鏡檢測(cè)活力高于90%，置于碎冰上，0-4°C保存NaCl 7g/L 和 KH2PO4L Og/L 和水待用；
[0020]將上述采集的新鮮精子經(jīng)過(guò)按1:2的體積比例與抗凍液混合在碎冰中(O°C )輕輕震蕩、充分混勻3min，并分裝到2ml凍存管中，而后以20 °C -/min的降溫速率降溫至-80 °C，然后以-30°C /min降至_150°C，分裝到凍存盒，置于液氮容器中，進(jìn)行長(zhǎng)期超低溫冷凍保存，保存凍精65管；
[0021]其中，抗凍液由抗凍劑、添加劑和稀釋液組成；稀釋液為質(zhì)量濃度7g/L NaCl,1.0g/L KH2PO4和水；抗凍劑為10%的丙二醇(PG)，添加劑為濃度為10g/L的葡萄糖和1g/L海藻糖，即抗凍液為每升水中NaCl 7g，KH2PO4L 0g，萄糖糖10g，海藻糖10g，1mL PG(V/V) O
[0022]首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl 7g和KH2PO4L Og然后定容至IL備用；采用已配置的稀釋液作為基礎(chǔ)液配置抗凍液，其中含10% PG(ViV)(即10mL抗凍液含1mLPG);然后將已配置好的抗凍液作為基礎(chǔ)液，加入葡萄糖lg，海藻糖Ig,定容至100mL。
[0023]將上述冷凍保存的雜交鲆凍精解凍采用37°C水浴解凍，將凍存管盒從液氮罐的層架中取出，放置于存有液氮的保溫盒中，從凍存