一種類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3及其編 碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 波羅蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.)屬于?？扑愔参?，主要種植于熱 帶、亞熱帶區(qū)域。果實(shí)香味濃郁，酸甜可口，深受我國南方消費(fèi)者的青睞。波羅蜜不僅是一 種特色水果資源，其枝葉組織富含一類特殊結(jié)構(gòu)的黃酮類物質(zhì)，即異戊烯基類黃酮。該種黃 酮類物質(zhì)比常見結(jié)構(gòu)的黃酮類物質(zhì)生物活性更強(qiáng)，例如其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性、免疫 調(diào)節(jié)活性等方面，均比沒有異戊烯基化的黃酮類物質(zhì)更顯著。波羅蜜組織中異戊烯基類黃 酮的含量不僅高，而且結(jié)構(gòu)種類豐富，目前已發(fā)現(xiàn)有二十余種不同結(jié)構(gòu)形式的異戊烯基類 黃酮。由此可見，波羅蜜既是豐富的異戊烯基類黃酮天然資源，也是類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶 的豐富資源。異戊烯基類黃酮在腫瘤等疾病治療方面具有非常重要的價(jià)值，具有廣泛的應(yīng) 用前景。因此，利用菠蘿蜜固有的天然優(yōu)勢，通過生物技術(shù)的手段來開發(fā)一種生物合成異戊 烯基類黃酮的方法將具有重要的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3及其編碼基因 AhFDT3。
[0004] 本發(fā)明的類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 本發(fā)明還提供了編碼上述類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3的類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶基因 AhFDT3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3在制備異戊烯基類黃 酮中的應(yīng)用。
[0007] 所述的應(yīng)用優(yōu)選是將芹菜素加入表達(dá)類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3的釀酒酵母 菌液中，經(jīng)類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3催化產(chǎn)生異戊烯基芹菜素。
[0008] 所述的應(yīng)用優(yōu)選是以類黃酮和異戊烯基供體作為底物，經(jīng)類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶 AhFDT3催化產(chǎn)生異戊烯基類黃酮。
[0009] 優(yōu)選，所述的催化，其反應(yīng)體系的pH值為7~9,反應(yīng)溫度為20~40°C。
[0010] 優(yōu)選，所述的類黃酮為芹菜素，所述的異戊烯基供體為二甲基丙烯基焦磷酸，經(jīng)類 黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3催化產(chǎn)生異戊烯基芹菜素。
[0011] 優(yōu)選，所述的類黃酮為山奈酚，所述的異戊烯基供體為二甲基丙烯基焦磷酸，經(jīng)類 黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3催化產(chǎn)生異戊烯基山奈酚。
[0012] 本發(fā)明從菠蘿蜜中克隆得到類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3,其編碼的類黃酮 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3具有良好的催化合成異戊烯基類黃酮的活性。通過利用類黃酮異 戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得超量表達(dá)類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn) 移酶AhFDT3的釀酒酵母；利用其菌液或微粒體催化異戊烯基供體和類黃酮底物合成異戊 烯基類黃酮，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)27%，產(chǎn)物純度可達(dá)76-90%。本發(fā)明為異戊烯基類黃酮的生物 合成提供了一種新的方法，具有操作簡便，反應(yīng)污染小，產(chǎn)物純度高等優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0013] 圖1是異戊烯基芹菜素的一級(jí)質(zhì)譜圖。
[0014] 圖2是異戊烯基芹菜素的二級(jí)質(zhì)譜圖。
[0015] 圖3是釀酒酵母陽性菌的菌落PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0016] 圖4是異戊烯基山奈酚的一級(jí)質(zhì)譜圖。
[0017] 圖5是異戊烯基山奈酚的二級(jí)質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0019] 下列實(shí)例中未具體注明的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。
[0020] 實(shí)施例1 :克隆類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3、構(gòu)建超表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化釀酒 酵母
[0021] 提取波羅蜜葉片的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 的cDNA。以該cDNA為模板，采用正向引物GCCACCATGGCTCAAGTTGG，反向引物 TATGAGTGGAAATATTATATACTCTGCAT，TakaRa 公司 Ex Taq DNA 聚合酶，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；PCR 條 件為：94°C，5min ;94°C，45s、56°C，lmin、72°C，I. 5min ;35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。采用瓊 脂糖凝膠電泳回收目的片段，將目的片段送交測序。經(jīng)測序分析，克隆得到類黃酮異戊烯基 轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其含有1191個(gè)堿基，編碼的蛋白命 名為類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3,共396個(gè)氨基酸，具體氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 不O
[0022] 連接類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3至超表達(dá)載體pYes2. 1T0P0(購自 Invitrogen公司，貨號(hào)K4150-01)上，連接反應(yīng)條件為：類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3、質(zhì)粒 pYes2. 1T0P0、1.2M NaCl、0. 06M MgClJg合后，室溫放置 30min 完成連接反 應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒（類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3插入到超表達(dá)載體pYes2. 1T0P0 后的重組質(zhì)粒）。然后將重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化條件為：向酵母 感受態(tài)細(xì)胞中加入2 μ L重組質(zhì)粒、5 μ L鮭魚精DNA，混勻；加入600 μ L轉(zhuǎn)化液（轉(zhuǎn)化液 配方為：ImL 50% PEG，125 μ L 10 X ΤΕ，125 μ L 10 X LiAc)，30°C、IOOrpm 搖床轉(zhuǎn)化 30min; 加入70 μ L DMSO (二甲基亞砜），42°C熱激15min ;冰浴放置2min后13000rpm離心5s，加 200 μ L IXTE懸浮細(xì)胞，涂布SC-U抑制平板，30°C培養(yǎng)3~5天。菌落PCR篩選重組質(zhì) 粒成功轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞的陽性菌，篩選方法為：挑選單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至50 μ L無菌水， 100°C加熱5min，離心去除細(xì)胞碎片；取10 μ L上清液，加入5 μ L Ex Taq DNA聚合酶緩沖 液、1以1^101111(1階1^，141^正向引物6〇^〇^了66(：1^六611^，141^來自質(zhì)粒序列的反向引 物 ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT，0· 5 μ L Ex Taq DNA 聚合酶，31. 5 μ L 無菌水，混合；PCR 程序 為：94°C，5min ;94°C，40s ;56°C，40s ;72°C，I. 5min ;35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。PCR 產(chǎn)物 用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，圖3的M為marker，1為陽性菌，該陽性菌能夠擴(kuò) 增出目的片段，表明類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3插入到超表達(dá)載體pYes2. Π?ΡΟ后 的重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞，再經(jīng)測序驗(yàn)證確認(rèn)，由此得到將類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn) 移酶基因 AhFDT3插入到超表達(dá)載體pYes2. 1Τ0Ρ0后的重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞 的陽性菌，命名為釀酒酵母pYes2. lT0P0-AhFDT3。對(duì)釀酒酵母pYes2. lT0P0-AhFDT3進(jìn)行大 量培養(yǎng)，首先挑釀酒酵母口￥682.11'(^041^0了3轉(zhuǎn)移至5〇1^3(：1抑制培養(yǎng)基（2%葡萄糖為 碳源），30°0,200印111，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；離心收集細(xì)胞，用3(：1誘導(dǎo)培養(yǎng)基（2%半乳糖， 1 %棉子糖為碳源）稀釋至0D600 = 0· 4, 30°C，200rpm，培養(yǎng)24h。用SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng) 釀酒酵母pYes2. lT0P0-AhFDT3,誘導(dǎo)其超量表達(dá)類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3,即獲得超 量表達(dá)類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AhFDT3的釀酒酵母菌液。
[0023] 實(shí)施例2 :合成類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3、構(gòu)建超表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化釀酒 酵母
[0024] 采用全合成的方法直接合成類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3全長序列 (具體如SEQ ID NO. 1所示），按照實(shí)施例1的方法連接類黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 AhFDT3至超表達(dá)載體pYes2. 1T0P0上，再轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，得到釀酒酵母 pYes2. lT0P0-