一種檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)（Lateral Flow Assay)檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒所用的引物和探針組合及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)引起的牛病毒性腹瀉 粘膜病，是牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床上以發(fā)熱、腹瀉、黏膜糜爛、潰瘍、白細(xì) 胞減少、持續(xù)感染與免疫耐受、免疫抑制、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸型胎以及致死性粘膜 病為主要特征。該病呈世界性分布，感染情況復(fù)雜，持續(xù)性感染個(gè)體癥狀隱蔽，動(dòng)物帶毒率 高，特別是BVDV嚴(yán)重影響感染動(dòng)物的繁殖，給全球畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因而被 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)列為發(fā)病必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病之一。
[0003] 目前檢測(cè)BVDV的主要方法有病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、血清 中和試驗(yàn)、電鏡檢查等，但這些方法不僅操作繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)耗力，而且難以用于BVDV的現(xiàn) 場(chǎng)診斷。因此，亟需建立一套快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的診斷方法，為該病的現(xiàn)場(chǎng)診斷提供新一代的 檢測(cè)技術(shù)與手段。
[0004] 重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于 PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，主要有結(jié)合單鏈核酸重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶 三種酶參與。其原理是利用重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋 找同源序列。在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開(kāi)始配對(duì)形 成復(fù)制所需的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，對(duì) 模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。引物序列的設(shè)計(jì)與選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。在 RPA擴(kuò)增體系中加入一個(gè)生物素標(biāo)記的反向引物和5'熒光標(biāo)記的探針，探針標(biāo)記的熒光基 團(tuán)30個(gè)堿基處有一個(gè)脫堿基位點(diǎn)（dSpacer)，該位點(diǎn)是DNA修復(fù)酶作用的底物，可被核酶 nfo識(shí)別切割，產(chǎn)生新的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，從而使雙標(biāo)信 號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的累積同步，檢測(cè)結(jié)果可在抗FAM金標(biāo)結(jié)合和抗生物素捕獲抗體的側(cè)流層析 試紙條上顯示。
[0005] 目前對(duì)于RPA技術(shù)的研宄尚處于起步階段，且國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有將側(cè)流層析RPA技術(shù) 應(yīng)用于BVDV檢測(cè)的報(bào)道。本發(fā)明系首次采用RPA結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)建立快速檢測(cè)BVDV的 方法，并通過(guò)特異性和靈敏度評(píng)價(jià)，可用于臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為BVDV的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供一種靈 敏、可靠的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)RPA側(cè)流層析技術(shù)應(yīng)用于BVDV臨床現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明提供了 一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)BVDV的RPA檢測(cè)方法。僅需通過(guò)對(duì)臨床樣品進(jìn)行病毒RNA的提 取，以及一步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，不需要熱循環(huán)反應(yīng)，不必在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò) 增，結(jié)果可在側(cè)流層析試紙條上清晰顯示，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)程序簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí) 間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛場(chǎng)快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的進(jìn)行牛病毒性腹瀉病毒的診治。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0008] -種用于通過(guò)RPA技術(shù)檢測(cè)BVDV的引物和探針組合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列如SEQ ID No. 3所示。
[0009] 正向引物：5' -CCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGAC-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0010] 反向引物：5' -【Biotin】CAATACAGTGGGCCTCTGCAGCACCCTATCAGGC-3' ；（SEQ ID No. 2)
[0011] 探針序列：5' -【FAM】CTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCA【dSpacer】 AGCACATCTTAACCTG【C3-spacer】3'（探針5' -端用FAM標(biāo)記，距離5' -端30個(gè)堿基左右 的位置處用dSpacer替代一個(gè)堿基，3'端用C3_spacer阻斷）。（SEQ ID No. 3)
[0012] 需要說(shuō)明的是：與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA反應(yīng)所需引物的長(zhǎng)度通常為30-35bp， 探針序列的長(zhǎng)度為46-52bp，引物設(shè)計(jì)時(shí)為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度 的增加也使引物設(shè)計(jì)及選擇難度的增加，因此，引物的設(shè)計(jì)和選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。 RPA技術(shù)正處于起步研宄階段，尚無(wú)專(zhuān)門(mén)的引物、探針設(shè)計(jì)軟件，也沒(méi)有大量的數(shù)據(jù)為其引 物設(shè)計(jì)原則提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)多對(duì)引 物進(jìn)行優(yōu)化、篩選才能得到。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)BVDV的試劑盒，該試劑盒中包含有用于通過(guò)RPA技術(shù)檢 測(cè)BVDV的引物和探針組合。
[0014] 進(jìn)一步的，該檢測(cè)試劑盒中還包括有：BVDV陽(yáng)性對(duì)照模板、RPA擴(kuò)增試劑、去離子 水和側(cè)流層析檢測(cè)試劑。BVDV陽(yáng)性對(duì)照模板、RPA擴(kuò)增試劑、去離子水與引物和探針組合一 起構(gòu)成RPA擴(kuò)增體系。
[0015] 所述RPA擴(kuò)增試劑包括Rehydration緩沖液、大腸桿菌來(lái)源的recA重組酶、鏈置 換DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液。
[0016] 所述RPA側(cè)流層析檢測(cè)試劑包括側(cè)流層析試紙條，雜交檢測(cè)緩沖液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0017] 所述BVDV陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法為：分別在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物對(duì)的上游和下游設(shè)計(jì)引物：
[0018] 上游引物：5' -agtggtgagttcgttggatggc-3'（SEQ ID No. 4);
[0019] 下游引物：5' -catgtgccatgtacagcagaga-3'（SEQ ID No. 5);
[0020] 以BVDV基因組cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50yL :10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5yL、2. 5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5yL(5U/yL)、模板 2yL， 10 ymol/L的上下游引物各2 yL，滅菌超純水加至50 yL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min，然 后進(jìn)入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，最后停止于4°C。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至pEAST-T3載體（該載體為常規(guī)的 載體，商業(yè)化購(gòu)買(mǎi)到），藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，送華大基因進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)， 正確的重組質(zhì)粒為BVDV陽(yáng)性對(duì)照模板。
[0021] 具體的，一種檢測(cè)BVDV的試劑盒，每50yL RPA擴(kuò)增體系中含有正向引物、反向引 物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探針 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，BVDV 陽(yáng)性對(duì)照模板 2 μ L，Rehydration 緩沖液29. 5 μ L，去離子水11. 2 μ L和醋酸鎂溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0022] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用RPA技術(shù)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)檢測(cè)BVDV的方法，步驟如 下：
[0023] (1)應(yīng)用快速提取病毒RNA試劑盒提取BVDV細(xì)胞培養(yǎng)病毒上清液的RNA，按照Fe rmentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)，獲得 BVDV的cDNA模板；
[0024] (2)根據(jù)BVDV保守區(qū)域設(shè)計(jì)RPA特異性引物和探針，向RPA擴(kuò)增試劑盒推 薦反應(yīng)的50 yL擴(kuò)增體系中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 μ mol/L)，探針 0· 6 yL(10 ymol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 緩沖液，11. 2 yL 去離子水和 2. 5 μ L醋酸鎂溶液（280mM)，于含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反應(yīng)管中，恒溫水浴 鍋內(nèi)38 °C反應(yīng)25分鐘；
[0025] (3)應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，若側(cè)流層析試紙條上顯現(xiàn)出檢測(cè)帶 和對(duì)照帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，若試紙條僅顯示對(duì)照帶，則結(jié)果為陰性。
[0026] 應(yīng)用上述方法可以篩選出一套可快速有效檢測(cè)出BVDV成分的引物及探針組合。
[0027] 以已知病毒滴度為2. OX IO5TCID5tZmL的BVDV用DEPC水進(jìn)行10倍系列稀釋后， 提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示可以檢測(cè)到2TCID 5(I的靶標(biāo)分子，證明該方法 具有較高的靈敏度