能夠鑒定吳江香青菜的issr-scar標記及其鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子標記鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種能夠鑒定吳江香青菜的ISSR-SCAR 標記及其鑒定方法。
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【背景技術(shù)】
[0003] 青菜（Ara1S1Sica CAiflefl1Si1S L.)也叫小白菜、不結(jié)球白菜，屬十字花科蕓薹屬，為 一年生或二年生草本，是重要的蔬菜和油料作物。青菜原產(chǎn)中國，但是近年來東南亞及歐美 等一些國家也逐步引種栽培，目前成為世界性的蔬菜。其中香青菜不僅是我國獨有的青菜 品種，而且是蘇州地方傳統(tǒng)特色珍稀蔬菜品種。至今已有100多年的栽培歷史，主要種植在 沿東太湖及太湖西南岸，涉及吳江的震澤、橫扇、七都、桃源以及松陵、平望、盛澤等鎮(zhèn)的部 分地區(qū)。由于吳江香青菜香味濃郁，品質(zhì)柔嫩，風(fēng)味獨特，其優(yōu)勢別的地方無法復(fù)制，2009 年，經(jīng)農(nóng)業(yè)部評定，吳江香青菜成為江蘇省省首批、蘇州市第一個國家農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記 保護的農(nóng)產(chǎn)品。目前對吳江香青菜的鑒別主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，如植株半披張、葉片長橢 圓形、葉緣程淺波紋皺褶、葉面鄒成波狀突起等。但由于大部分青菜品種苗期相似，直到成 株才開始表現(xiàn)出品種的特性，所以對其品種的鑒定往往需要一定時間。因此，為了更加有效 地區(qū)分外形相似的不同青菜品種，保護地理標志產(chǎn)品的種質(zhì)資源，開發(fā)出穩(wěn)定、準確地鑒別 地理標志產(chǎn)品的技術(shù)體系迫在眉睫。
[0004] 近年來，DNA分子標記技術(shù)逐步成熟和完善，在遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、親緣關(guān)系 分析和基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用。目前常用的DNA分子標記主要有基于DNA分 子雜交的RFLP、小衛(wèi)星DNA等和基于PCR反應(yīng)的RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中序 列特異性擴增區(qū)域（SeqKence characterized amplified regions, SCARs)標記通常是由 RAPD、SRAP、ISSR標記轉(zhuǎn)化而來，是將上述分子標記篩選出的特異標記片段進行克隆和測 序，根據(jù)其堿基序列設(shè)計一對特異引物，用于對特征擴增區(qū)域的特異性擴增。SCAR標記一般 表現(xiàn)為擴增片段的有無，是一種顯性標記，具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強等優(yōu)點，目前已成為 育種實踐中能直接應(yīng)用的首選標記。
[0005] 雖然目前DNA分子標記技術(shù)在青菜中已取得了一定的研宄成果，但主要集中在遺 傳多樣性和遺傳圖譜構(gòu)建方面，在品種鑒定方面的報道大多是通過SSR指紋圖譜對青菜品 種進行鑒別，但由于該方法操作繁瑣、重復(fù)性差，并且不是可直接應(yīng)用的專一性、特異性分 子標記，因此不適合用于穩(wěn)定、快速、準確的品種鑒別體系的開發(fā)。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠鑒定吳江香青菜的ISSR-SCAR標記及其鑒定方法， 通過提供鑒別吳江香青菜的一個DNA片段、一組特異性鑒別引物和一種鑒別方法，實現(xiàn)對 吳江香青菜品種的特異性鑒定，為保護地理標志產(chǎn)品的種質(zhì)資源提供有力的技術(shù)支持。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 本發(fā)明涉及一個能夠在吳江香青菜中擴增出特異性條帶的ISSR引物，所述引物的核 苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本發(fā)明所述核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示的引物是通過22條ISSR引物對香吳 江青菜和其它10種江淮地區(qū)主栽的青菜品種(包括上海青、小八葉、黑心烏、中其白、蘇州 青、五月慢、高梗白、矮腳黃、四月慢和黃心烏)進行PCR擴增，篩選出的能夠在吳江香青菜中 擴增出特異性條帶的引物。
[0010] 本發(fā)明涉及一個吳江香青菜特異性DNA片段，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本發(fā)明所述核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示的基因是使用核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示的引物在吳江香青菜中擴增出的一條特異性條帶，該擴增條帶只出現(xiàn)在吳江香青 菜中，而在其它青菜品種中沒有。將該特異性條帶進行克隆和測序獲得其核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明涉及一組特異性鑒別吳江香青菜的SCAR引物，其中上游引物為SEQ ID NO. 3,下游引物為SEQ ID NO. 4,分布對應(yīng)于SEQ ID NO. 2片段的ll-33nt及1168-1191nt 位點。
[0013] 本發(fā)明提供一種吳江香青菜的DNA分子鑒別方法，其特征在于利用特異性鑒別吳 江香青菜的SCAR引物對待檢青菜品種的10個個體DNA樣品進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物 通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在IlSlbp處出現(xiàn)擴增條帶的樣品為吳江香青菜，而相同部 位沒有出現(xiàn)條帶的樣品不是香青菜。
[0014] 本發(fā)明所述的鑒別吳江香青菜的PCR反應(yīng)體系為20 μL，其組分及終濃度為：DNA 模板（20 ng/^l)1.0 μ1，2Χ 反應(yīng)混合物（含20 mM Tris-HCl，100 mM KC1，3 mM MgC12,400 μΜ 的 dNTPs，溴酚藍）10.0 μL，引物（10 mM)各 0.8 Pl，Taq DNA 聚合酶（2·5υ/μ1)0·4 μL， 最后用雙蒸水補齊至20 μL。PCR程序為：94°C，5min預(yù)變性；94°C變性45s，55°C退火45s， 72°C延伸Imin，30個循環(huán)；最后72°C延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳， 溴化乙錠（EB)染色，電壓80V，電泳0. 5h后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，用2000bp的DNA ladder作為分子量標記。
[0015] 有益效果：本發(fā)明是首次對國家農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記保護的農(nóng)產(chǎn)品一一吳江香青 菜進行分子標記的研宄，本發(fā)明提供的鑒定吳江香青菜的ISSR-SCAR標記方法具有操作簡 單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)對吳江香青菜品種的特異性鑒定，對于保護地理 標志產(chǎn)品的種質(zhì)資源具有重要的意義。
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【附圖說明】
[0017] 圖1是香青菜和10個其它青菜品種的ISSR引物（SEQ ID NO. 1)擴增圖譜。
[0018] 泳道1-11從左至右依次為：香青菜、上海青、小八葉、黑心烏、中其白、蘇州青、五 月慢、高梗白、矮腳黃、四月慢和黃心烏，泳道M為DNA Marker。
[0019] 圖2是香青菜和其它青菜品種各10個單株的ISSR-SCAR(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)檢測圖譜。
[0020] A為香青菜，B為上海青，C為小八葉；D為黑心烏；E為中其白；F為蘇州青；G為五 月慢；H為高梗白；I為矮腳黃；J為四月慢；K為黃心烏。泳道1-10為該品種的10個不同 單株，泳道M為DNA Ma