一種改造后的犬α1-干擾素基因、表達(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種改造后的犬α 1-干擾素基因、表達(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素(IFN)是在特定的誘導(dǎo)劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒活性的糖蛋白，當(dāng)它再次作用于其他細(xì)胞可以使其立即獲得抗病毒，抗腫瘤等多方面的免疫力。大量體外和體內(nèi)試驗(yàn)表明，犬α 1-干擾素對生產(chǎn)中具重大威脅的病毒傳染病均具有防御和抑制作用。干擾素以其作用廣泛、殘留小等特點(diǎn)，有較廣闊的應(yīng)用前景。但是由于干擾素成本價(jià)格高和動物經(jīng)濟(jì)價(jià)值的問題，在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用還主要局限于寵物疾病的治療，在產(chǎn)業(yè)動物的治療主要局限在試驗(yàn)階段，而且主要輔助治療病毒病和寄生蟲病。因此，犬α 1-干擾素的高效表達(dá)以及成本的降低意義重大。
[0003]目前，利用酵母和大腸桿菌表達(dá)干擾素的工作取得了一些成果，例如專利申請?zhí)?00310109820.6公開了一種含大腸桿菌偏嗜密碼子的豬α -干擾素。本發(fā)明人課題組前期的專利申請200810027952.7公開了一種經(jīng)修飾的豬α -干擾素基因、表達(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白的制備方法，對于豬α-干擾素的制備取得了較好的成果。
[0004]雖然，利用酵母表達(dá)干擾素的工作取得了一些成果，但是對于不同的基因、不同物種來源的同源基因(基因的序列和性質(zhì)等具有差別)，如何修飾干擾素基因，致使其與酵母的偏嗜性匹配，以提高干擾素的表達(dá)量；表達(dá)過程中怎樣進(jìn)行培養(yǎng)、怎樣保證獲得蛋白表達(dá)需要的溶解氧、怎么樣避免污染、加甲醇誘導(dǎo)的量以及時間、對蛋白表達(dá)時間的控制即蛋白收獲時間、無菌檢驗(yàn)的方法、蛋白含量以及活性的測定等均有較大的差異，沒有形成一個穩(wěn)定的、完整的技術(shù)方案，不利于發(fā)展犬α 1-干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)，不能從根本上解決犬α 1-干擾素的成本問題，影響其推廣應(yīng)用。
[0005]為了提高犬α 1-干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)水平，降低生產(chǎn)成本，形成工業(yè)化生產(chǎn)條件，有必要探索一種針對犬α 1-干擾素基因進(jìn)行修飾、確定修飾位點(diǎn)、修飾數(shù)量的方法，有必要對其誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵條件進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化設(shè)置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有犬α 1-干擾素制備技術(shù)的缺陷和不足，提供一種經(jīng)修飾的可與畢赤酵母匹配的犬α 1-干擾素基因、建立一種可在畢赤酵母中穩(wěn)定、高效表達(dá)犬α 1-干擾素的技術(shù)方法，為企業(yè)化生產(chǎn)犬α 1-干擾素，提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
[0007]鑒于密碼子的兼并性和酵母菌對氨基酸密碼子的偏嗜性，本發(fā)明對犬α 1-干擾素基因的14種關(guān)健密碼子進(jìn)行了修飾，使其能滿足酵母菌對氨基酸密碼子的偏嗜性，但并沒有改變干擾素蛋白的氨基酸和氨基酸的排列順序，從而大大地提高了該基因在畢赤酵母中的表達(dá)水來。本發(fā)明對犬α 1-對干擾素的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括溶氧量的控制，減少污染的措施，甲醇的添加時間和添加量，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度和收獲蛋白的時間，蛋白含量的測定方法，蛋白活性的測定擴(kuò)大培養(yǎng)條件等。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種經(jīng)修飾改造的犬α 1-干擾素基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]具體地，上述經(jīng)修飾改造的犬α 1-干擾素基因是對犬α 1_干擾素基因的核苷酸序列中14個關(guān)鍵密碼子進(jìn)行了修飾后得到，所述14個關(guān)鍵密碼子為Cys、Pro、Leu、Thr、Gly、Val、Gin、Ala、Ser、Asn、Phe、Asp、Lys 和 Arg 對應(yīng)的密碼子。
[0010]更具體地，所述14個關(guān)鍵密碼子為為Cys的密碼子UGU，Pro的密碼子CCG，Leu的密碼子⑶C，Thr的密碼子ACG，Gly的密碼子GGU，Val的密碼子GUG，Gln的密碼子CAG，Ala的密碼子GCC，Ser的密碼子AGC，Asn的密碼子AAU，Phe的密碼子UUC，Asp的密碼子GAC，Lys的密碼子AAA，Arg的密碼子CGU。
[0011]一種犬α 1-干擾素表達(dá)載體，其構(gòu)建使用了分泌型的表達(dá)載體PPICZa C，所述表達(dá)載體含有EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)，一個強(qiáng)啟動子AOXl啟動子，一個Zeocin抗性選擇位點(diǎn)，強(qiáng)分泌信號α因子信號肽如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
[0012]其中，所述α因子信號肽包含83個氨基酸的前導(dǎo)肽和間隔肽，所述間隔肽由Iys-Arg -Glu-Ala- Glu-Ala氨基酸序列組成，Iys-ArgC端由膜結(jié)合蛋白酶ΚΕΧ2基因產(chǎn)物識別，-Glu-Ala-外側(cè)由STE13基因產(chǎn)物識別。
[0013]一種上述經(jīng)修飾改造的犬α 1-干擾素基因編碼的蛋白質(zhì)(即犬α 1_干擾素)的制備方法，包括以下步驟:
51.根據(jù)犬α1-干擾素的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成一對引物，合成犬α 1-干擾素基因；所述引物序列如下:
上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ；
下游引物 P2:5’_ GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’ ；
上游引物Pl在其3’端加入了&…I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物Ρ2在其5’端加入了 Xba I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；并在EcoR I酶切位點(diǎn)的上游增加一個堿基G ；
犬α 1-干擾素基因測序正確后，對犬α 1-干擾素基因的核苷酸序列中14個關(guān)鍵密碼子進(jìn)行修飾改造，改造的位點(diǎn)主要是:為Cys的密碼子UGU，Pro的密碼子CCG，Leu的密碼子CUC，Thr的密碼子ACG，Gly的密碼子GGU，Val的密碼子GUG，Gln的密碼子CAG，Ala的密碼子GCC，Ser的密碼子AGC，Asn的密碼子AAU，Phe的密碼子UUC，Asp的密碼子GAC，Lys的密碼子AAA，Arg的密碼子CGU ；
本發(fā)明參照酵母密碼子偏愛性改造去除信號肽后的犬α 1-干擾素密碼子，首先確保編碼蛋白的氨基酸不會改變，在此基礎(chǔ)上選擇酵母表達(dá)系統(tǒng)偏愛的密碼子，將原稀有密碼子替換，同時考慮Α+Τ含量和G+C含量，兩者過高或過低都會降低蛋白翻譯效率甚至導(dǎo)致蛋白表達(dá)，而且不能出現(xiàn)提前終止的序列，綜合考慮各方面因素合理的對原基因成功進(jìn)行了修飾；
52.將經(jīng)修飾的犬α1-干擾素基因克隆入酵母表達(dá)載體pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板篩選，激活培養(yǎng)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行無菌檢驗(yàn)； 53.收獲蛋白，收獲過程中進(jìn)行蛋白無菌檢驗(yàn)；
54.測定蛋白的含量及活性。
[0014]其中，步驟S2包括以下步驟:
521.用滅菌牙簽挑YPDS平板上生長的具有Zeocin抗性的單菌落，挑于1.5 ml的BMGY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行激活培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28?30°C，200轉(zhuǎn)/min振蕩過夜，至0D600=2?6，細(xì)胞處于對數(shù)生長期；
522.將步驟S21獲得的細(xì)胞在3000轉(zhuǎn)/min和室溫條件下離心5分鐘收集沉淀，重懸于1.5 ml的BMMY培養(yǎng)基中，控制溶氧量和防止污染，在15 ml的試管中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；所述控制溶氧量和防止污染是用四層干凈的紗布外加兩層報(bào)紙包扎BMMY、采用進(jìn)行酒精噴霧消毒和/或控制培養(yǎng)基的體積占培養(yǎng)器皿容積的5?20% ；
523.每間隔24h加入100%甲醇至終濃度為1%，加入量為每毫升BMMY培養(yǎng)基加10微升，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0015]步驟S2所述無菌檢驗(yàn)是在蛋白表達(dá)過程中，觀察菌液的顏色，保證菌液為乳白色；或在培養(yǎng)過程中取菌液進(jìn)行鏡檢，觀察酵母菌的形態(tài)，所述鏡檢是直接涂片鏡檢或用復(fù)紅染色鏡檢。
[0016]步驟S3所述收獲蛋白為培養(yǎng)96?120h后室溫下1500?3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集上清，棄菌體；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存；步驟S3所述無菌檢驗(yàn)采用聞酵母發(fā)酵的味道和觀察菌液顏色；或利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。
[0017]由述制備方法制備得到的經(jīng)修飾改造的犬α 1-干擾素基因編碼的蛋白質(zhì)，即犬α 1-干擾素，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018]本發(fā)明對溶氧量的控制和減少污染的措施，是在實(shí)驗(yàn)表達(dá)過程中，不斷摸索在保證酵母不受污染的情況下如何能更好地保持酵母的通氣的前提下，通過采用四層干凈紗布外加兩層報(bào)紙包裹搖瓶口或試管口，既保證了通氣性又保證了酵母不受污染。在搖床使用過程中還需經(jīng)常進(jìn)行酒精噴霧消毒以盡可能保證外界環(huán)境的無菌。同時，培養(yǎng)基的體積只能占培養(yǎng)器皿的5?20%，最高不能超過20%。
[0019]本發(fā)明對無菌檢驗(yàn)的方法的改進(jìn)包括:蛋白表達(dá)過程中，觀察菌液的顏色，乳白色是酵母菌正常的顏色；在培養(yǎng)過程中取菌液進(jìn)行鏡檢，觀察酵母菌的形態(tài)，可以直接涂片鏡檢，也可以用復(fù)紅染色鏡檢。在顯微鏡下，沒有染色的酵母菌是白色圓型的菌體，染色的酵母菌是紅色圓型的菌體，沒有其它形態(tài)的菌體出現(xiàn)，這說明培養(yǎng)的酵母菌沒有污染。收獲過程中聞酵母發(fā)酵的味道，甜的是沒有污染的，如果出現(xiàn)很臭的味道，并且菌液顏色是暗黑的，則說明在培養(yǎng)過程中污染了大腸桿菌；用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，干擾素蛋白只有I條20KD左右的條帶，如果污染了除了目的條帶之外還會出現(xiàn)很多其它的蛋白條帶。