母菌一些種已知和潛在Δ12-脂肪酸脫氫酶基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物(引物I和引物2)，以CDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列如下:
引物 1:RKD12F:5'-ATAAGCTTATGGCCGCTACCCTCCGCCAGC-3' (SEQ ID NO:1)
引物 2:RKD12R:5'-ATGAATTCCTAGAGTCCCTCGACGCCCGAGT-3' (SEQ ID N0:2)
先用真核細(xì)胞總RNA提取試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas公司產(chǎn)品)反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA，然后以其為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增體系(25 μυ組成如下:
1XEx Taq Buffer2.5 ?
dNTP (2.5 Wnol/L)2 μ?
模板3 μ?
Pl (10 Mmol/L)2 μ?
Rl (10 Mmol/L)2 μ?
Ex Taq DNA polymerase (5U/M-L) 2 M-L無(wú)菌ddH20補(bǔ)足至25 M-L
擴(kuò)增條件:94°C變性4min，再用94°C lmin、55°C Imin>72°C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C 1min ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用上述相同的方法鑒定、測(cè)序，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示得到了一段1341bp長(zhǎng)的序列，如GenBank登錄號(hào)為KJ502671.1中所示的核苷酸序列。
[0014]實(shí)施例2:釀酒酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)實(shí)施例1所得序列的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物(引物3和引物
4)分離其潛在的開放閱讀框序列:
引物 3:RKD12F:5'-ATAAGCTTATGGCCGCTACCCTCCGCCAGC-3'
引物 4:RKD12R:5'-ATGAATTCCTAGAGTCCCTCGACGCCCGAGT-3'
此兩個(gè)引物的5 '端下劃線部分分別含有I和Hind III酶切位點(diǎn)，所用的擴(kuò)增條件和反應(yīng)組分和以cDNA為模板的PCR反應(yīng)相同，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示和GenBank登錄號(hào)為KJ502671.1中所示l-1341bp的序列一致；然后取25μ1 PCR產(chǎn)物和1ul pYES3/CT(Invitrogen公司)分別進(jìn)行雙酶切，電泳回收酶切大片段，并用T4連接酶在16°C連接4h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HD5 α，通過質(zhì)粒提取和PCR篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序鑒定，所構(gòu)建的含有Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因的酵母表達(dá)命名為pY3RKD12。
[0015]實(shí)施例3:釀酒酵母重組表達(dá)載體PY3RKD12轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞
挑取釀酒酵母菌株INVSCl單菌落于5ml YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床過夜培養(yǎng)，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于10ml的YEH)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床搖至0D600于1.3-1.5之間；4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，用10ml預(yù)冷的無(wú)菌ddH20洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，再用50ml預(yù)冷的無(wú)菌ddH20洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，細(xì)胞用0.5ml的預(yù)冷的IM山梨醇懸浮，每80μ1分裝于1.5ml預(yù)冷的離心管中，取2Pg重組表達(dá)載體pY3RKD12(附圖1)和空載體PYES3/CT分別加入到80ul的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后轉(zhuǎn)至0.2cm的電轉(zhuǎn)杯中，冰上孵育5min，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)儀中電擊(電擊條件:電壓1.5kV，電容25PF，電阻200 Ω，電擊時(shí)間為4-10ms)，電擊完畢后立即加入Iml IM預(yù)冷的山梨醇并吹勻，30°C孵育2h后分別涂布于SC-Trp (無(wú)色氨酸)選擇培養(yǎng)基上，置30°C培養(yǎng)3-4天。
[0016]實(shí)施例4:酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與脂肪酸甲酯的氣相色譜分析
挑取分別轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體PY3RKD12和空載體pYES3/CT并在SC-Trp選擇培養(yǎng)基(色氨酸合成缺陷型培養(yǎng)基)平板上出現(xiàn)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別接種于15ml液體SC-Trp選擇培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)，30°C搖菌培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接于10ml的SC-Trp選擇培養(yǎng)基(含2%的半乳糖和1%的棉子糖)中，使其初始0D600為0.4，同時(shí)添加0.5mM外源性的油酸作為底物，30°C繼續(xù)培養(yǎng)72h，4000g離心收集菌體，用去離子水洗滌三次，菌體于50°C烘干，研碎，取10mg干菌體粉末加入5ml 5%的KOH-CH3OH溶液中，70°C反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用6M的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.0，加入4ml 14%BF3_CH30H，70°C反應(yīng)1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入1ml飽和的NaCl溶液，劇烈震蕩混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用8ml 1:4的氯仿:環(huán)己烷抽提兩次，合并兩次的提取液，把含有脂肪酸甲酯的溶劑用氮?dú)獯蹈?，?00μ1的正己烷回溶樣品，最后用0.45Mm微孔濾膜過濾除去大顆粒雜質(zhì)。
[0017]采用氣相色譜分析儀器分析轉(zhuǎn)基因酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)情況，氣相色譜分析儀器為島津GC-7A，柱子:彈性石英毛細(xì)管柱，0.32X30m，固相支持物為聚二乙二醇丁二酸酯鍍膜物:聚酰亞胺。載氣:N2，線速10cm/s。分流比:100:1，氣化室溫度:250°C，柱溫:180 °C,尾吹:50ml/min，檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器，把上述制備的脂肪酸甲酯化樣品進(jìn)行GC分析，上樣量為?μ? ;分析軟件:Anstar。
[0018]色譜分析結(jié)果見圖2和圖3，圖2顯示含pYES3/CT空載體的轉(zhuǎn)基因酵母，圖3顯示含重組質(zhì)粒PY3RKD12的轉(zhuǎn)基因酵母；與圖2相比，圖3中出現(xiàn)保留時(shí)間為16.65min對(duì)應(yīng)的新峰為α-亞麻酸甲酯，與α-亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品一致，說明本發(fā)明的Δ12-脂肪酸脫氫酶也具有催化亞油酸生產(chǎn)α-亞麻酸的能力，具有Λ 15-脂肪酸脫氫酶活性，可以將其應(yīng)用于生產(chǎn)α-亞麻酸等多不飽和脂肪酸上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.λ12-脂肪酸脫氫酶基因在生產(chǎn)α-亞麻酸中的應(yīng)用，該基因的GenBank登錄號(hào)為KJ502671.10
【專利摘要】一種Δ12-脂肪酸脫氫酶基因的新用途。本發(fā)明公開了一種從圓紅冬孢酵母YM25235中分離的編碼Δ12-脂肪酸脫氫酶基因序列的新用途，即應(yīng)用在生產(chǎn)多不飽和脂肪酸中，基因編碼產(chǎn)物具有Δ15-脂肪酸脫氫酶的活性，能催化亞油酸轉(zhuǎn)化成α-亞麻酸。
【IPC分類】C12N15/53, C12N15/81, C12P7/64
【公開號(hào)】CN104894146
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510270911
【發(fā)明人】張琦, 楊曉霞, 季秀玲, 魏云林, 林連兵
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月26日