大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花黃萎病是一種土傳的維管束系統(tǒng)病害，是由大麗輪枝菌引起的，其對棉花的 生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。自1935年，棉花黃萎病隨著棉花種子的引進(jìn)而傳入我國，隨后便 開始逐漸蔓延全國。尤其從20世紀(jì)90年代以后，棉花黃萎病在我國擴(kuò)展蔓延極為迅速，其 中1993年棉花黃萎病最為嚴(yán)重，發(fā)病面積達(dá)266. 67萬hm2,隨后在1995、1996、1999、2000、 2002、2003年全國范圍內(nèi)連續(xù)爆發(fā)，損失十分嚴(yán)重，棉花黃萎病已對我國棉花生產(chǎn)以及可持 續(xù)發(fā)展構(gòu)成極大威脅。
[0003] 棉花黃萎病是由半知菌亞門（Deutermycotina)淡色菌科（Mmonilaceae)輪 枝菌屬（Verticillium)真菌引起，屬內(nèi)有若干個(gè)種，其中危害棉花的有大麗輪枝菌 (V. dahliae)和黑白輪枝菌（V. albo-atum)兩個(gè)種。我國棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌 引起的。大麗輪枝菌沒有寄主?；?，可以危害多種植物，從一年生的草本植物到多年生的 木本植物。大麗輪枝菌可以形成一種叫做黑色微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，可以在缺乏寄主的土壤 中存活長達(dá)數(shù)年。
[0004] 大麗輪枝菌主要以微菌核的形式越冬，微菌核作為其最主要的初侵染來源，在受 到植物根部分泌物的刺激時(shí)便會(huì)萌發(fā)。菌絲一般從植物根部侵入，隨著植物的蒸騰作用向 植物的莖葉中擴(kuò)展、定植，最終侵染整個(gè)植株。一般被大麗輪枝菌侵染過的植株都會(huì)表現(xiàn)出 萎蔫，干枯，葉脈失色，壞死等癥狀，維管束變褐是黃萎病最典型的癥狀。
[0005] 田黎等的研宄認(rèn)為棉花黃萎病的發(fā)生發(fā)展與土壤中微菌核的數(shù)量密切相關(guān)。大麗 輪枝菌微菌核的多少通常與其致病力和抗逆性相關(guān)。有研宄顯示，當(dāng)土壤里棉花黃萎菌微 菌核達(dá)到〇. 03個(gè)/g 土?xí)r，就會(huì)導(dǎo)致棉花出現(xiàn)萎蔫癥狀，當(dāng)土壤中微菌核含量達(dá)到0. 3個(gè)/g 土~I. 0個(gè)/g 土?xí)r，就會(huì)有20 %~50%的棉花植株發(fā)病，當(dāng)土壤中微菌核含量達(dá)到3. 5個(gè) /g 土以上，棉花植株都會(huì)發(fā)病。另有研宄表明，當(dāng)土壤中微菌核含量達(dá)到0. 5個(gè)/g 土為引 起棉花發(fā)病的臨界值。在田里面，當(dāng)黃萎菌侵染萵苣后，土壤中的微菌核數(shù)量為至少50個(gè) /g 土，而病害很重的田塊，微菌核數(shù)目高達(dá)2400個(gè)/g 土。
[0006] 棉花是目前世界上種植面積最大的工業(yè)原料作物，在我國是僅次于糧食的第二大 農(nóng)作物。棉花黃萎病是目前我國棉花生產(chǎn)過程中最具毀滅性的真菌病害。由于至今尚未研 制出效果顯著的防治藥劑和抗病品種，被稱為棉花的"癌癥"，因此如何控制黃萎病的猖獗 危害，已成為棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。在這種情況下，研宄大麗輪枝菌的致病機(jī) 理，了解大麗輪枝菌與寄主的互作機(jī)理就顯得更為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白 VdpdaA3或其基因。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種制備分生孢子產(chǎn)量降低的重組大麗 輪枝菌的方法。
[0009] 本發(fā)明所提供的一種制備分生孢子產(chǎn)量降低的重組大麗輪枝菌的方法，是抑制目 的大麗輪枝菌中大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因的表達(dá)，得到分生孢子 產(chǎn)量低于所述目的大麗輪枝菌的重組大麗輪枝菌；
[0010] 所述大_輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3為a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白質(zhì)；
[0012] b)將SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3活性的由a)衍生的 蛋白質(zhì)。
[0013] 其中，SEQ ID No. 1由312個(gè)氨基酸殘基組成。
[0014] 上述b)中所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10 個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述b)中所述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得 到。
[0016] 上述b)中所述蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQ ID No. 2所示的DNA序列中缺失 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變得到的。
[0017] 上述方法中，所述分生孢子產(chǎn)量降低的重組大麗輪枝菌的分生孢子產(chǎn)量低于所 述目的大麗輪枝菌；所述目的大麗輪枝菌為含有所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白 VdpdaA3的基因的大麗輪枝菌，如大麗輪枝菌野生型菌株V592。
[0018] 上述方法中，所述抑制目的大麗輪枝菌中所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白 VdpdaA3的基因的表達(dá)是通過將所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因敲 除的方式實(shí)現(xiàn)的。
[0019] 上述方法中，所述基因敲除可通過同源重組實(shí)現(xiàn)。
[0020] 本發(fā)明提供的利用所述制備分生孢子產(chǎn)量降低的重組大麗輪枝菌的方法獲得的 分生孢子產(chǎn)量降低的重組大麗輪枝菌也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021] 本發(fā)明所提供的抑制所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3表達(dá)的物 質(zhì)、抑制所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因表達(dá)的物質(zhì)或降低所述大 麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3活性的物質(zhì)在培育抗大麗輪枝菌植物中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022] 上述應(yīng)用中，所述抗大麗輪枝菌植物可為轉(zhuǎn)基因植物。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述植物可為大麗輪枝菌的寄主；所述大麗輪枝菌的寄主可為雙子 葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物可為棉花、番茄、向日葵、黃瓜等；所述單子葉植物 可為水稻、玉米、高粱、麥類、谷子等；所述大麗輪枝菌的寄主具體可為棉花。
[0024] 本發(fā)明所提供的抑制所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3表達(dá)的物 質(zhì)、抑制所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因表達(dá)的物質(zhì)或降低所述大 麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3活性的物質(zhì)在制備大麗輪枝菌抑制劑中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025] 上述應(yīng)用中，所述大麗輪枝菌抑制劑可通過所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋 白VdpdaA3或所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行篩選。
[0026] 上文中，所述抑制大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因表達(dá)的物 質(zhì)可為干擾大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的基因表達(dá)的物質(zhì)，如microRNA、 VdpdaA3的基因的反義基因表達(dá)的RNA。
[0027] 本發(fā)明還提供了所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3,或所述大麗輪 枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3相關(guān)的生物材料在調(diào)控大_輪枝菌分生孢子產(chǎn)量中 的應(yīng)用；
[0028] 所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3相關(guān)的生物材料為下述Al)至 A20)中的任一種：
[0029] Al)核酸分子；所述核酸分子為編碼大_輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3 的核酸分子；
[0030] A2)含有Al)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0031] A3)含有Al)所述核酸分子的重組載體；
[0032] A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0033] A5)含有Al)所述核酸分子的重組微生物；
[0034] A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0035] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0036] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0037] A9)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0038] A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0039] All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0040] A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0041] A13)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0042] A14)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0043] A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0044] A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0045] A17)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0046] A18)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0047] A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0048] A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0049] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量可為降低大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn) 量。
[0050] 上述應(yīng)用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0051] 所述核酸分子為如下1)-5)中任一所不的基因：
[0052] 1)其編碼序列是SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0053] 2)序列是SEQ ID No. 3的cDNA分子或DNA分子；
[0054] 3)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述大麗輪枝菌 分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0055] 4)與2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述大麗輪枝菌 分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0056] 5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述大麗 輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0057] 上述用于編碼所述大_輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的核酸分子，本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明 的編碼所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3的核酸分子的核苷酸序列進(jìn)行突 變。那些經(jīng)過人工修飾的，與本發(fā)明分離得到的編碼所述大麗輪枝菌分生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋 白VdpdaA3的核酸分子的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且編碼所述大麗輪枝菌分 生孢子產(chǎn)量相關(guān)蛋白VdpdaA3,均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0058] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的SEQ ID No. 2的第1-939位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。與本發(fā)明的SEQ ID No. 3的第1-1205位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高， 或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一