己糖激酶2作為鼻咽癌放療預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物，具體是將介導(dǎo)鼻咽癌中有氧糖酵解異常活化的己糖激酶 2作為預(yù)測鼻咽癌放射治療預(yù)后的新生物標(biāo)志物。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在一套有別于正常細(xì)胞的異常代謝模式，為其無限增殖、侵襲轉(zhuǎn)移 等惡性表型快速而有效的提供生物合成所需的能量及原料，腫瘤細(xì)胞代謝異常主要涉及到 糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和核酸代謝等，這種異常的代謝 模式改變成為為腫瘤細(xì)胞的代謝重編程（Metabolic reprogramming)。
[0003] 糖是一類化學(xué)本質(zhì)為多羥醛或多羥酮及其衍生物的有機(jī)化合物，其最主要的生理 功能是為生命體提供能量，并且是生物大分子合成過程中碳骨架的重要來源。以葡萄糖的 分解代謝為例，多糖類物質(zhì)經(jīng)由消化系統(tǒng)分解為葡萄糖等單糖；單糖經(jīng)由消化道吸收進(jìn)入 細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)糖酵解途徑分解成少量ATP和丙酮酸；在氧氣充足的情況下，丙酮酸脫羧生成乙 酰輔酶A，經(jīng)過氧化磷酸化途徑，最終生成ATP及其他生物合成所需的中間體；但在無氧的 狀況下，丙酮酸則還原生成乳酸，就此完成葡萄糖代謝全過程。
[0004] 腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞主要通過增強(qiáng)有氧酵解途徑獲得能量（ATP)，葡萄糖代謝至丙酮 酸后不再進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行有氧氧化，而是通過乳酸脫氫酶，轉(zhuǎn)變成乳酸。腫瘤中的這種 有氧糖酵解特征命名為腫瘤細(xì)胞瓦伯格效應(yīng)（Warburg Effect)。
[0005] 在糖酵解途徑中，葡萄糖分子首先通過細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（Glucose transporter)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，葡萄糖在己糖激酶（Hexokinase)的催化下 通過消耗ATP磷酸化為6-磷酸葡萄糖。進(jìn)一步，6-磷酸葡萄糖在磷酸己糖異構(gòu)酶 (Glucose-6-phosphate isomerase)的催化下生成6-磷酸果糖；接著6-磷酸果糖會(huì)在磷 酸果糖激酶（Phosphofructokinase)的作用下通過消耗ATP磷酸化生成1，6_二磷酸果 糖，ATP則轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP。兩個(gè)磷酸基團(tuán)可以進(jìn)一步在醛縮酶（Aldolase)的參與下分解為 磷酸二輕丙酮和3-磷酸甘油醛。磷酸二輕丙酮會(huì)在磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triose-phosphate isomerase)幫助下轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛。兩分子3-磷酸甘油醛會(huì)被NAD+和3-磷酸甘油 酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)氧化生成 1，3_ 二磷酸甘油酸。 1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸，高能磷酸鍵由1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)移到ADP上， 生成兩分子ATP。磷酸甘油酸變位酶（Phosphoglycerate)推動(dòng)3-磷酸甘油酸生成磷酸稀 醇式丙酮酸。最后，在丙酮酸激酶的作用下磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸。在糖酵 解途徑異?；罨哪[瘤細(xì)胞中，目前的研宄證實(shí)多個(gè)糖酵解相關(guān)酶在多種腫瘤組織中高表 達(dá)，如己糖激酶 2(Hexokinase 2)、丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase muscle，PKM2)、乳酸脫 氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH)等。上述糖酵解相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞中異?；罨?，既 是腫瘤細(xì)胞瓦伯格效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，同時(shí)也為開發(fā)新的腫瘤分子診斷和靶向治療提供了可 能。因此，腫瘤代謝研宄作為腫瘤學(xué)研宄的快速發(fā)展的前沿領(lǐng)域，其研宄成果已經(jīng)開始轉(zhuǎn)化 成為腫瘤診斷和治療的新手段和新策略。
[0006] 鼻咽癌是中國南方人群高發(fā)的惡性腫瘤，每年全球近8萬例新發(fā)病例，其中50% 以上的新發(fā)病例來自于中國。鼻咽癌病理類型主要為低分化鱗癌，鼻咽解剖部位的特點(diǎn) 及組織特性決定了放射治療是鼻咽癌的首選治療方式。臨床上發(fā)現(xiàn)放療抵抗、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移 是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。因此，開發(fā)新的用于預(yù)測鼻咽癌放療預(yù)后的的分子標(biāo)志物 (Bio-marker)以及放療增敏的策略是降低鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、提高病人生存率，降低死亡率 的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于確定鼻咽癌中糖酵解途徑是否異?；罨捌洚惓；罨姆肿?機(jī)制，明確介導(dǎo)鼻咽癌糖酵解異常活化基因與鼻咽癌放療預(yù)后的相關(guān)性。
[0008] 本發(fā)明利用代謝組學(xué)分析平臺(tái)，分析了永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞中的代 謝狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)乳酸（lactate)和山梨醇（sorbitol)的含量在鼻咽癌細(xì)胞中顯著增加。乳 酸是糖酵解途徑（glycolysis pathway)的最終產(chǎn)物，山梨醇是細(xì)胞儲(chǔ)存葡萄糖的重要代謝 物質(zhì)。乳酸和山梨醇在鼻咽癌細(xì)胞中含量增加，提示糖酵解途徑可能在鼻咽癌細(xì)胞中異常 活化，且鼻咽癌細(xì)胞中葡萄糖的攝入能力高于永生化鼻咽上皮細(xì)胞。進(jìn)一步我們通過臨床 生化檢測儀證明，鼻咽癌細(xì)胞的葡萄糖攝取速率和乳酸生成速率顯著增加。
[0009] 通過PCR array方法篩選在鼻咽癌細(xì)胞中異常高表達(dá)的糖酵解相關(guān)分子，發(fā)現(xiàn)鼻 咽癌細(xì)胞中己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)轉(zhuǎn)錄顯著增高。Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)HK2在 多種鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)。抑制HK2能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增值速率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并 增加鼻咽癌細(xì)胞對于放射處理的敏感性。
[0010] 進(jìn)一步，我們在鼻咽癌臨床組織樣本中用免疫組組化學(xué)方法檢測了 HK2,證實(shí)約 50%的鼻咽癌患者組織中HK2呈高表達(dá)水平。對鼻咽癌患者的預(yù)后進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn) HK2高表達(dá)的鼻咽癌患者的平均生存周期顯著低于HK2低表達(dá)的患者。因此，鼻咽癌細(xì)胞中 高表達(dá)的HK2是鼻咽癌細(xì)胞中糖酵解途徑異常活化的重要分子基礎(chǔ)。在鼻咽癌組織中HK2 的高表達(dá)水平，可用于預(yù)測鼻咽癌患者的放療預(yù)后。
[0011] 基于上述研宄結(jié)果，本發(fā)明提出生物標(biāo)志物HK2(己糖激酶2)可應(yīng)用在鼻咽癌放 療敏感性診斷試劑和/或鼻咽癌放療預(yù)后預(yù)測試劑的制備中。
[0012] 具體的，該診斷試劑和/或預(yù)測試劑通過檢測被試者（鼻咽癌患者）組織中HK2 的表達(dá)水平或基因轉(zhuǎn)錄水平，并與正常水平相比較來診斷鼻咽癌放療敏感性以及預(yù)測放療 預(yù)后情況，從而為鼻咽癌放射治療提供參考指標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，可以使用定量PCR的 方法來檢測鼻咽癌組織中HK2基因的轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄水平與鼻咽癌對放射治療的敏感性負(fù) 相關(guān)；還可以利用免疫組織化學(xué)檢測鼻咽癌組織中HK2的表達(dá)水平，鼻咽癌組織中HK2的高 表達(dá)量與鼻咽癌臨床預(yù)后不良正相關(guān)。
[0013] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種檢測鼻咽癌放療敏感性和/或預(yù)測鼻咽癌放療預(yù)后的 試劑盒，包括：
[0014] (l)mRNA 提取試劑；
[0015] (2)逆轉(zhuǎn)錄試劑；
[0016] (3)定量 PCR 試劑；
[0017] 其中，定量PCR試劑中包含所述生物標(biāo)志物HK2基因的特異性引物。優(yōu)選的，所述 定量PCR試劑中包含的HK2特異性定量PCR引物序列是：
[0018] 上游引物：5' -GAGCCACCACTCACCCTACT-3'（SEQ ID No :5);
[0019] 下游引物：5' -CCAGGCATTCGGCAATGTG-3'（SEQ ID No :6)。
[0020] 本發(fā)明還提供的一種檢測鼻咽癌放療敏感性和/或預(yù)測鼻咽癌放療預(yù)后的免疫 組化試劑盒，包括特異性針對HK2的抗體。該試劑盒利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通 過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（例如熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì) 胞內(nèi)抗原（HK2)，對其進(jìn)行定位、定性及定量。
[0021] 另一方面，生物標(biāo)志物HK2(己糖激酶2)或其基因可應(yīng)用于治療鼻咽癌藥物的制 備中。途徑之一是設(shè)計(jì)特異性靶向HK2的siRNA，有效干擾鼻咽癌細(xì)胞中HK2的表達(dá)，由此 抑制鼻咽癌細(xì)胞的增值和誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，增加鼻咽癌細(xì)胞對于放射處理的敏感 性。
[0022] 所述特異性靶向