家蠶血細胞特異表達基因組織蛋白酶o調(diào)控元件的鑒定的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及生物技術領域，家蠶血細胞特異性表達蛋白酶〇基因啟動 子分析與鑒定。具體涉及家蠶血細胞特異性表達基因的篩選方法及由蛋白酶〇基因啟動子 的克隆，分析發(fā)現(xiàn)其血細胞特異表達調(diào)控元件的方法。
【背景技術】
[0002] 家蠶是一種具有重要經(jīng)濟價值的昆蟲，作為鱗翅目的模式生物，家蠶在理論研宄 和生產(chǎn)應用方面都具有重要作用。目前對家蠶血細胞的研宄比較少，主要原因是可以利用 的研宄手段有限。隨著家蠶基因組框架圖和精細圖譜繪制工作的相繼完成，人類對家蠶的 研宄和認識已經(jīng)進入后基因組時代，"發(fā)現(xiàn)基因，研宄基因，利用基因"是我們現(xiàn)在研宄家蠶 的主要策略，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多的家蠶血液特異表達基因，面對這些大量的未知基因，如何 研宄和利用這些基因是我們目前要解決的主要任務之一。隨著家蠶轉基因技術的突破和完 善，轉基因已經(jīng)成為家蠶研宄基因和利用基因的強有力工具，但轉基因技術也需要其他研 宄工具的配合才能更好的發(fā)揮功效。這些血細胞特異高量表達的基因可能具有非常重要的 作用，其中也包括不少和家蠶免疫抗性相關的基因，要通過轉基因來研宄和利用這些家蠶 血細胞特異高量表達的基因就需要有一個家蠶血細胞特異高量表達的啟動子，但目前沒有 家蠶血細胞特異高量表達啟動子的相關報道。研宄家蠶血細胞特異性的表達基因及其功能 與調(diào)控，對于闡釋家蠶血細胞的生長發(fā)育分子機理具有重要意義。
[0003] Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)提供快速有效的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。此方 法基于讓已經(jīng)轉入桿狀病的質粒的位點特意轉座子的表達框的質粒在大腸桿菌中擴增。 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)主要包括：pFastBac捐獻質粒的選擇，它要能夠產(chǎn)生包含目 的位點的表達結構，這個目的基因的產(chǎn)生被桿狀病毒特意位點啟動子控制。一個大腸桿菌 宿主，DHlOBac，包含桿狀病毒質粒（桿粒）和輔助質粒，在轉染pFastBac表達結構后可以 產(chǎn)生重組桿粒。一個控制表達的質粒，包括Gus或CAT基因，以便在感染細胞后產(chǎn)生重組桿 狀病毒，表達β -葡萄糖酸酐酶或氯霉素乙酰轉移酶。Y. Zhai等人以Bac-to-Bac系統(tǒng)結合 螢光素酶報告基因重構載體分析了家蠶乙酰葡糖胺糖苷酶的啟動子活性，表明啟動子活性 與基因表達水平一直于在血液、皮膚、脂肪體高表達，截斷分析發(fā)現(xiàn)基因 -347~-223bp存 在核心調(diào)控元件。J. 等人應用轉基因技術分析了家蠶內(nèi)源性卵黃蛋白原基因啟動子 的功能特性，實驗表明其啟動子只在蛹期雌性家蠶脂肪體表達，具有性別，組織、時間三重 特異的表達模式。高志宏等利用Bac-to-Bac系統(tǒng)對絲素重鏈啟動子進行研宄，在絲腺中， 2. Ikb的啟動子僅在后部絲腺驅動EGFP蛋白的表達，而在中部絲腺中不表達，0. 9k~2. Ik 的區(qū)域可能存在其他的順式調(diào)控元件
[0004] 本研宄首先通過家蠶組織芯片表達數(shù)據(jù)、轉錄組數(shù)據(jù)和RT-PCR等方法，篩選出蛋 白酶0基因為血細胞特異表達候選基因。然后對相關基因進行克隆，并對候選基因的啟動 子區(qū)進行克隆。我們成功對Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)進行了改進，建立了一套有效的 血細胞啟動子檢測體系。最后在細胞和個體水平對候選基因啟動子活性進行檢測，并對其 組織特異性進行了驗證。通過本研宄得到家蠶血細胞特異性基因蛋白酶O基因啟動子，分 析發(fā)現(xiàn)其啟動子在轉錄起始位點上游-333到-80之間片段具有組織特異性調(diào)控元件，控制 該基因在血細胞的特異表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及到家蠶血細胞特異性表達蛋白酶0基因啟動子分析與鑒定。具體涉及 家蠶血細胞特異性表達基因的篩選方法及由蛋白酶〇基因啟動子的克隆，分析發(fā)現(xiàn)其血細 胞特異表達調(diào)控元件的方法。
[0006] 1、首先通過家蠶組織芯片表達數(shù)據(jù)、轉錄組數(shù)據(jù)和定量RT-PCR等方法，篩選出血 細胞特異表達候選基因蛋白酶〇基因，成功驗證該基因家蠶血細胞特異表達。
[0007] 2、成功對相關基因啟動子進行克隆，并進行功能分析。
[0008] 3、克服了無家蠶血細胞特異啟動子這一困難，我們成功對Bac-to-Bac桿狀病毒 表達系統(tǒng)進行了改進，建立了一套有效的血細胞啟動子檢測體系。最后在細胞和個體水平 對候選基因啟動子活性進行檢測，并對其組織特異性進行了驗證。為家蠶血細胞特異高量 表達基因的研宄和利用提供了有利的工具。
[0009] 4、通過本研宄得到家蠶血細胞特異性基因蛋白酶0基因啟動子，分析發(fā)現(xiàn)其啟動 子在轉錄起始位點上游-333到-80之間片段具有組織特異性調(diào)控元件，控制該基因在血細 胞的特異表達。
[0010] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下
【附圖說明】
[0011] 圖1芯片數(shù)據(jù)篩選家蠶血細胞特異基因
[0012] 家蠶組織芯片數(shù)據(jù)進行過濾，表達強度大于800,則認為該基因表達，分析發(fā)現(xiàn)芯 片探針號為SW05834和SW17255,兩個探針在SilkDB數(shù)據(jù)庫中對應的同一個注釋基因編號 為BGIBMGA009231，該基因表達集中在血液中，且表達量較高，表明具有血液特異性。
[0013] 圖2家蠶組織蛋白酶0組織表達譜
[0014] 提取家蠶各組織的RNA反轉成cDNA之后進行Real Time PCR檢測，結果證明了組 織蛋白酶0基因在血液中特異表達。
[0015] 圖3 5' RACE片段克隆結果
[0016] 1 :保守序列克隆；2 :5' RACE片段；
[0017] 利用PCR和RACE技術，克隆得到了家蠶組織蛋白酶0的5'末端序列，確定了組織 蛋白酶0基因的轉錄起始位點（TSS)。
[0018] 圖4 TFSEARCH對啟動子組織蛋白酶0啟動子轉錄因子
[0019] 在線使用TFSEARCH對啟動子轉錄因子進行分析HSF :heat shock facteor (熱 激蛋白因子）Dfd :Deformed 元件 BR-C :Broad_Complex 元件 Hb : (Hunchback)元件 Kr : (Krueppel)元件 TSS :轉錄起始位點。圖中表示了 pBmCat0(1912bp，_1836/+76，）、 pBmCatOl(1530bp，-1454/+76)、pBmCat02(938bp，-862/+76)、pBmCat03(409bp，-333/+76)、 and pBmCat04(l56bp，_8〇/+76)引物的位點。
[0020] 圖5組織蛋白酶0啟動子序列各截斷示意圖
[0021] 圖6組織蛋白酶0啟動子序列各截斷片段PCR圖
[0022] I :PBmCat0(1912bp，-1836/ + 76,）2 :pBmCat01 (1530bp，-1454/ + 76) 3 : pBmCat02(938bp， -862/+76)4 :pBmCat03(409bp， -333/+76)5 :and pBmCat04 (156bp, -80/+76) M ：marker
[0023] 按照（圖4)示意圖對家蠶組織蛋白酶0基因組序列分別設計該基因各截短啟動 子。SEQ ID No :16 ~SEQ ID No :21 所示的擴增引物 pBmCat〇-F/pBmCat〇-R，pBmCat01-F/ pBmCat〇-R，pBmCat02_F/pBmCat〇-R，pBmCat03_FpBmC/pBmCat〇-R 和 pBmCat04_F/pBmCat〇-R 引物對分別擴增出 pBmCat0(1912bp，-1836/+76,），pBmCat01(1530bp，-1454/+76)， pBmCat02(938bp，-862/+76)，pBmCat03(409bp，-333/+76)，and pBmCat04(156bp，-80/+76) 的啟動子片段，分別測序驗證，證明克隆啟動子的正確。
[0024] 圖7 pFastBac?Dual載體以及載體改裝示意圖
[0025] 圖7-a為pFastBac?Dual載體結構圖，圖7-b為載體改裝示意圖：pPH作為陽性對 照含有兩個啟動子P pitl啟動子能驅動EGFP表達的，P PH啟動DsRed的表達，P Λ P作為陰性對 照，只含有能驅動EGFP表達的Ppici, PHS為實驗組Ppici驅動EGFP表達，而我們的組織蛋白酶 〇的啟動子驅動DsRed的在組織中的表達。EGFP信號代表了被病毒侵染的程度，而DsRed 信號表示啟動是否在該組織有活性。
[0026] 圖8組織蛋白酶0啟動子片段重組Bacmid的鑒定
[0027] 圖 8-a 中，1 :藍斑 2 :白斑 A 3 :白斑 B 4 :白斑 C (1-4 引物為 EGFP-R/M13-R) 5 : 藍斑6 :白斑A 7 :白斑B 8 :白斑C(5-8引物為M13-F/M13-R) 9、Marker圖8-b中1 :藍斑 2 :pFast 空載 3 :pPH 4 :pCat0(l-5 引物為 EGFP-R/M13-R) 6 :2K plus marker 7 :藍斑 8 : pFast 空載 9 :pPH 10 :pCatO
[0028] (7-11 引物為 M13-F/M13-R) 12 :marker
[0029] 白色單菌落擴大培養(yǎng)提取重組病毒Bacmid，M13F/M13R引物分別位于病毒Bacmid 的轉座元件mini-attTn7的兩側，當無外源基因插入時PCR擴增會出現(xiàn)約300bp，轉化后發(fā) 生重組的Bacmid PCR產(chǎn)物會明顯增大大小為2560bp加上插入克隆片段的大小，如圖所示 pCatO重組Bacmid用SEQ ID NO 14~SEQ ID吣：15所示的擴增引物組34/]?13-1?對可 以擴出6000bp的片段，而藍斑沒發(fā)生重組只有300bp大小，說明發(fā)生了重組，EGFP-R/M13-R 引物對能在白斑擴出4000bp左右的特異片段，而藍斑無法擴出任何片段說明，插入的片段 就是我們克隆的啟動子序列已經(jīng)EGFP和dsred的片段。同樣的原理對pFast空載以及pPH 也做了鑒定，說明了載體的構建準確，已經(jīng)重組Bacmid的正確性。
[0030] 圖9組織蛋白酶0啟動子各截短片段在細胞系SWU-3上啟動子活性檢測
[0031] 通過細胞轉染和病毒感染swu-3細胞發(fā)現(xiàn)，陰性對照p Λ P只能表達綠色熒光蛋白 說明病毒感染的狀況，陽性對照PPH能