一種定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物和探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種定量檢測(cè)柑橘半穿刺線 蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在柑橘根圍有多種的植物寄生線蟲，但只有少數(shù)的幾種能對(duì)柑橘的產(chǎn)量造成影 響。其中柑橘半穿刺線蟲危害最嚴(yán)重的一種線蟲，因此，這種線蟲也被稱為柑橘線蟲。柑 橘半穿刺線蟲（ira/75·)分布廣泛，目前在世界各個(gè)主要的柑橘種植 區(qū)域都發(fā)現(xiàn)該種線蟲。劉國坤指出在中國的80%以上的柑橘種植園中都有該種線蟲存在。 柑橘半穿刺線蟲危害后會(huì)引起柑橘的"慢性衰退病"，該種病能造成超過30%以上的產(chǎn)量損 失。
[0003] 柑橘"慢性衰退病"的診斷非常困難，因?yàn)樵摬〉陌Y狀主要是黃化、萎蔫、植株生長 緩慢、葉片較小和較少、果實(shí)較小和產(chǎn)量下降，這些癥狀與由于缺水或缺乏營養(yǎng)導(dǎo)致的癥狀 類似。目前，準(zhǔn)確的診斷該病的唯一方法就是鑒定土壤中是否存在柑橘半穿刺線蟲，以及判 斷這種線蟲的種群數(shù)量是否達(dá)到了危害閾值。這就需要進(jìn)行土壤采樣，然后鑒定線蟲種類 和測(cè)量柑橘半穿刺線蟲的數(shù)量。目前，柑橘半穿刺線蟲的鑒定主要還是通過形態(tài)學(xué)的方法， 然而通過形態(tài)學(xué)鑒定半穿刺線蟲需要認(rèn)真的觀察線蟲的形態(tài)和測(cè)量線蟲線蟲不同結(jié)構(gòu)的 大小，這要求鑒定的人員有多年的線蟲鑒定經(jīng)驗(yàn)，專業(yè)要求很高。同時(shí)由于在土壤中往往會(huì) 有多種線蟲同時(shí)存在，因此在測(cè)定柑橘半穿刺線蟲的數(shù)量時(shí)容易造成把其他種類線蟲也計(jì) 算為柑橘半穿刺線蟲。此外，對(duì)每一份樣品中的線蟲數(shù)量都通過人力進(jìn)行計(jì)算是一件非常 耗費(fèi)時(shí)間的工作，往往還會(huì)造成測(cè)量很不準(zhǔn)確，不適于同時(shí)鑒定和定量大批的樣品。
[0004] 劉國坤首先開發(fā)出一種通過PCR方法鑒定柑橘半穿刺線蟲的方法，但是該方法不 能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有柑橘半穿刺線蟲檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種 準(zhǔn)確、快速、特異性好、敏感性強(qiáng)的定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和 探針。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供上述引物和探針的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明公開了一組定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針，所述引 物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探針為Tsprol，探針Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 其中，所述探針Tsprol的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基 團(tuán) ECL。
[0010] 上述定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針在檢測(cè)和/或定量 檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲方面的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 上述定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針在制備檢測(cè)和/或 定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的試劑或試劑盒方面的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 應(yīng)用時(shí)，所述引物的優(yōu)選退火溫度為60°C。
[0013] 本發(fā)明還以上述引物和探針建立了一種定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定 量PCR方法。
[0014] PCR反應(yīng)體系為：I yL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0· 2 μΜ，探針Tsprol 0· 10 μ Μ，10 μ L實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混試劑和余量ddH20,共20 μ L。
[0015] PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 2min ;95°C 15s，退火溫度60°C 15s和72°C 15s，共 30循環(huán)； 其中，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混試劑包含有實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚 合酶，緩沖液和dNTP。
[0016] 另外以上述引物和探針構(gòu)建的柑橘半穿刺線蟲的檢測(cè)試劑盒也在本發(fā)明保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶、緩沖液和 dNTP〇
[0018] 更優(yōu)選地，所述試劑盒為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的反應(yīng)體系和反應(yīng) 程序同上所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。
[0019] 上述實(shí)時(shí)熒光PCR方法或上述檢測(cè)試劑盒在定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲方面的應(yīng) 用也在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0020] 在實(shí)際應(yīng)用工作中，利用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物和探針檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲時(shí)，大 致工作流程如下：首先提取待測(cè)樣品的DNA，再利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針或本發(fā)明建 立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于待測(cè)樣品DNA沒有特殊的要求，按照本領(lǐng)域常規(guī)方 法提取得到的樣品DNA均可用于檢測(cè)。
[0021] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明公開了一組定量檢測(cè)柑橘半穿刺線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針，不僅能 夠在定性檢測(cè)的同時(shí)，對(duì)柑橘半穿刺線蟲進(jìn)行定量分析，而且對(duì)柑橘半穿刺線蟲有非常好 的特異性和靈敏性。
[0022] 利用該引物和探針可以從混合線蟲樣品中特異性的檢測(cè)出柑橘半穿刺線蟲，所述 混合線蟲樣品包括任意幾種線蟲的混合樣品。另外，利用該引物和探針還可以從感染混合 線蟲的基質(zhì)樣品中特異性的檢測(cè)出柑橘半穿刺線蟲，所述基質(zhì)樣品包括柑橘半穿刺線蟲可 以感染或生存的任何介質(zhì)，如土壤、培養(yǎng)基、苗木組織等等。
[0023] 而且，利用該引物和探針對(duì)柑橘半穿刺線蟲的檢測(cè)靈敏性可達(dá)到0. 1條線蟲的靈 敏度，并且是從上述任意的混合線蟲樣品或基質(zhì)中進(jìn)行檢測(cè)，靈敏性非常好，有著非常好的 應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為電泳檢測(cè)不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增效率的影響。
[0025] 圖2為電泳條帶亮度分析不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增效率的影響。
[0026] 圖3為定量柑橘半穿刺線蟲數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；R2表示相關(guān)系數(shù)；E表示引物的擴(kuò) 增效率。Y軸表示的是Ct值，X軸表示的是柑橘半穿刺線蟲的數(shù)量。
[0027] 圖4為樣品中混合有不同種類的線蟲對(duì)檢測(cè)和定量柑橘半穿刺線蟲的影響。圖中 Ts表示僅含有1條柑橘半穿刺線蟲，Ts+Ce表示含有1條柑橘半穿刺線蟲和100條秀麗小 桿線蟲，Ts+Pc表示含有1條柑橘半穿刺線蟲和100條咖啡短體線蟲，Ce、Pc分別表示僅含 有100條秀麗小桿線蟲線蟲或100條咖啡短體線蟲，CK表示加入滅菌水作為模板。Y軸表 示的是熒光值，X軸表示的是循環(huán)數(shù)。
[0028]
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0030] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0031] 實(shí)施例1弓丨物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件優(yōu)化 1、引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中柑橘半穿刺線蟲的ITS DNA序列（基因登錄號(hào)為：FJ969705、⑶433381 JNl 12270、JNl 12269、⑶433403、⑶433405 )設(shè)計(jì) 了引物 TsFl 和 TsR2,以及特異探針 Tsprol0
[0032] 引物和探針的序列為 上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示 5' -GATGCTTTTGCCCCGTTGTG-3' 下游引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示 5' -GGTAAGAGCCGAGAAGGACA-3， 探針Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示 5' -FAM-TCTACCAGGTTGAGCAGAGTCCTT-ECL-3'。
[0033] 2、引物反應(yīng)條件優(yōu)化 (1)使用柑橘半穿刺線蟲DNA作為模板，分別以不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化上 述引物的退火溫度。
[0034] 所述DNA的提取按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。本實(shí)施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法進(jìn)行，具體如下：通過離心法收集線蟲或在體視鏡下挑取1條線蟲，然后加 入 16 yL 滅菌雙蒸水，2 yL 10XPCR buffer (無 Mg2+)(購于 Takara)和 2 yL 蛋白 酶K (600 mAnson U/mL)(購于Takara)，接著用針頭切割線蟲，隨后把該混合物置于65°C 中 Ih 和 95°C 中 15min。
[0035] PCR