基因的突變 基因 DNA模板數(shù)占野生型DNA模板數(shù)的20%) Jaqman探針技術(shù)保障了試劑盒的檢測為閉 管反應(yīng)，有效的避免了假陽性的產(chǎn)生，其檢測特異性也充分得到保證，而且檢測快速方便， 整個檢測過程只有80分鐘，而直接測序則需要2天的時間，而且是開管操作，PCR產(chǎn)物污 染的可能性大增。
[0073] 本發(fā)明中PCR (Past-PCR)的實施步驟： 1.陽性質(zhì)粒的構(gòu)建 在待檢測的ALDH2基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)的上下游設(shè)計一對PCR引物，其擴(kuò)增片段 的長度可在500bp的范圍內(nèi)，用gDNA為模板，采用常規(guī)PCR方法，擴(kuò)增出這一片段，通過 AT克隆的方式，將該片段克隆至測序的質(zhì)粒中，通常用Invitrogen的pCR2.1 Topo T載 體試劑盒，操作按說明書進(jìn)行，也可用其他廠家的T載體試劑盒，甚至可用自己制備的T載 體質(zhì)粒。得到的陽性克隆，經(jīng)測序驗證，證明序列的正確性，然后采用Stratagene公司的 Quickchange試劑盒，設(shè)計對應(yīng)位點(diǎn)的另一個基因型引物，通過Quickchange的方法，得到 該突變型別的陽性克隆，操作按說明書進(jìn)行，所得到的陽性質(zhì)粒都必須經(jīng)測序驗證為正確 方可進(jìn)入下一步的使用。Taqman定量質(zhì)粒，并用作模板以驗證給定的測定法的靈敏性、線性 動態(tài)范圍、特異性。
[0074] 2.等位基因特異性引物（ASP)的設(shè)計和篩選 在引物3'末端互補(bǔ)于對應(yīng)的基因突變堿基位點(diǎn)，而在引物3'末端倒數(shù)第二位或第三 位引入堿基錯配，或第二和第三位的連續(xù)錯配；針對不同的SNP或突變位點(diǎn)，在引物3'端倒 數(shù)第二位或第三位引入堿基錯配的基礎(chǔ)上，還可在引物的其它位點(diǎn)增加堿基錯配來滿足反 應(yīng)特異性的要求，越遠(yuǎn)離3'端，增加錯配的堿基數(shù)越多，在5'端可達(dá)最多的等位基因1特 異性引物。
[0075] ASP的篩選是利用構(gòu)建好的野生型和突變型重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行熒光定量PCR反 應(yīng)的交叉篩選，即當(dāng)用突變引物與野生型的模板進(jìn)行擴(kuò)增時，與用野生型引物同野生型模 板的反應(yīng)要多用19個循環(huán)數(shù)以上，反之亦然，那么這樣的引物就具備高度的特異性。將篩 選出的特異性引物用與對應(yīng)的重組質(zhì)粒作敏感性試驗，檢測靈敏度小于10-1000個拷貝的 引物即達(dá)到檢測的靈敏度要求，滿足上述兩個條件的引物就是我們選出的ASP引物，可進(jìn) 行下一步的檢測。
[0076] 3.擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備及加入被檢測樣品 (1)從試劑盒中取出各組成成分，室溫緩慢融化PCR緩沖液、dNTPs和Taq酶混合液、陽 性質(zhì)控品、空白對照，顛倒搖勻。每個反應(yīng)管需加入PCR緩沖液、Taq酶（dNTPs )、滅菌超純 水和DNA樣本。蓋緊管蓋，瞬時離心后轉(zhuǎn)移到PCR擴(kuò)增區(qū)。
[0077] (2)建議每次PCR反應(yīng)均同時進(jìn)行樣本、陽性質(zhì)控品、空白對照的分析，陽性質(zhì)控 品和空白對照的加樣方法同樣本加入方法。
[0078] 4.反應(yīng)條件 每個反應(yīng)管中（反應(yīng)終體積的范圍可在10-50 μ 1，最佳在20-25 μ 1反應(yīng)體積）包含 PCR緩沖液（IOmM Tris-HCl ρΗ8· 3, 50mM KC1, 0· l%Triton X-100,2. OmM MgCl2)，IO-IOOng DNA或1，000, OOO個拷貝的質(zhì)粒DNA，50nM-400nM -個共同的通用特異性Taqman探針，一 個50nM-2uM共同的通用反向特異性下游引物，50nM-2uM不同等位基因特異性上游引物， lpm-20pm檢測管家基因 GAPDH的上游引物，Ipm-20pm檢測管家基因 GAPDH的下游引物， 0· 05pm-5pm檢測管家基因 GAPDH的探針，再加上L 5單位Taq聚合酶，200 μ M dNTPs。
[0079] I )、循環(huán)條件設(shè)置
為使熒光曲線更加美觀，建議從第二步開始收集熒光信號。
[0080] 2)、儀器檢測通道選擇
熒光信號采集溫度設(shè)為60°C，具體設(shè)置方法請參照相應(yīng)儀器使用說明書。
[0081] 3 )、檢測類型設(shè)定：空白對照設(shè)為" NTC "，陽性質(zhì)控品和待檢樣本設(shè)為 "Unknown"。
[0082] 5.結(jié)果分析 如果檢測樣本僅有突變型反應(yīng)管在FAM通道有對數(shù)增長的擴(kuò)增曲線，同時VIC通道有 對數(shù)增長的擴(kuò)增曲線，可判定樣本為A型，即突變型純合子；如果檢測樣本僅有野生型反應(yīng) 管在FAM通道有對數(shù)增長的擴(kuò)增曲線，同時VIC通道有對數(shù)增長的擴(kuò)增曲線，可判定樣本為 G型，即野生型純合子；如果檢測樣本突變型和野生型反應(yīng)管在FAM通道均有對數(shù)增長的擴(kuò) 增曲線，同時VIC通道有對數(shù)增長的擴(kuò)增曲線，可判定樣本為AG型，即雜合子；由于本方法 結(jié)果是"全或無"，結(jié)果極易判斷，哪一個管有反應(yīng)，哪一個管就是陽性。 具體實施例
[0083] 下面以對ALDH2 (乙醛脫氫酶2)基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)突變檢測的情形為例，具 體對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0084] 實施例1 :針對ALDH2 (乙醛脫氫酶2)基因 rs671多態(tài)性檢測的野生型和突變型 陽性質(zhì)粒的制備 首先我們從基因庫中調(diào)出ALDH2基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)前后的基因序列，并將多態(tài)性 位點(diǎn)用雙下劃線標(biāo)記，在ALDH2基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)的上下游適當(dāng)位置(用黑體字和下 劃線標(biāo)示)，設(shè)計一對克隆引物，擴(kuò)增片段為274bp，突變位點(diǎn)包含其內(nèi)，基因序列顯示如下， SEQ No. 1 ： gggcaacagagaaagattctatctcaaaaaaaaaaatttttttttaagttaaaaataaaataaagactttggg gcaatacagggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaattacagggt caactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcg agtacgggctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggct tgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttgggggctcggggcctgccagaggttcagg acctgccggggactcagggcctgctggaagttcaggacctgctggggatcagggcctgccagggatttagggtct 實驗步驟如下： 1)提取基因組DNA 用國內(nèi)天根公司或Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒，提取基因組DNA，具體操作步 驟按說明書進(jìn)行。制備好的DNA標(biāo)本，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度，將其濃度調(diào)整到50ng/ μ 1，保存于_20°C，或直接進(jìn)行下面的反應(yīng)。
[0085] 2) AT克隆獲得陽性質(zhì)粒 首先在突變點(diǎn)上下游設(shè)計克隆引物，見表1 : 表1. ALDH2基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)野生型克隆引物
在 12·5μ1 的 2XPCR Master Mix (Fermentas)的 PCR 擴(kuò)增體系，加入 ΙΟμΜ 上游引 物和10 μ M下游引物，以及基因組DNA50ng，加水至總體積25 μ 1，PCR反應(yīng)條件設(shè)定為95°C 預(yù)變性3min，95°C變性10s，60°C退火及延伸30s，總共35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后取15 μ 1反 應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行濃度2. 5%的凝膠電泳，電泳結(jié)束后觀察，條帶與預(yù)測的大小相符，表明擴(kuò)增成 功。采用美國Life公司的pCR2.0 TOPO T載體，按其操作說明，通過TA克隆的方式，獲得 ALDH2基因的rs671位點(diǎn)野生型陽性質(zhì)粒，具體的基因序列如下，其中多態(tài)性位點(diǎn)顯示為G 型，說明為野生型，測序證明所獲質(zhì)粒正確。
[0086] SEQNo. 4 ：gggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaat tacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccggga gttgggcgagtacgggctgcaggcatacact_gaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctg ttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttggg 3)快速突變法獲得突變質(zhì)粒 然后，采用產(chǎn)生快速突變的方法（Quickchange，QC)，設(shè)計突變引物，引物序列見表2. 表2.獲得ALDH2基因的rs671多態(tài)性位點(diǎn)突變型克隆引物
按照（Stratagene公司）Quickchange試劑盒的反應(yīng)條件和步驟，完成突變體的構(gòu)建， 所得到的重組質(zhì)粒，具體的基因序列如下，經(jīng)測序驗證其中多態(tài)性位點(diǎn)顯示為A型，為突變 型，然后將突變型與野生型質(zhì)粒分別置_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0087] SEQ No. 7 ：gggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaa ttacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccggg agttgggcgagtacgggctgcaggcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcct gttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttggg 實施例2 :等位基因特異性引物（ASP)的設(shè)計和特異性篩選 針對ALDH2基因 rs671多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計野生型和一系列突變特異型引物如下： ALDH2 基因的 rs671_WT_F: gggctgcaggcatacagtg (SEQ Νο·8) ALDH2 基因的 rs671-mut_F: gggctgcaggcatacagta (SEQ Νο·9) ALDH2 基因的 rs671-mut_Fl: ggctgcaggcatacagta (SEQ Νο.10) ALDH2 基因的 rs671-mut_F2: gctgcaggcatacagta (SEQ No.ll) ALDH2 基因的 rs671-mut_F3: gctgcaggcatacacaa (SEQ No.12) ALDH2 基因的 rs671-mut_F4: ggctgcaggcatacacaa (SEQ No.13) ALDH2 基因的 rs671-mut_F5: gggctgcaggcatacacaa (SEQ No.14) 同時設(shè)計合成Taqman特異性探針： SEQ No. 15 ：FAM-cctgttggggcttgagggtc-BHQl〇
[0088] 相關(guān)引物和探針在生工生物工程(上海）有限公司進(jìn)行合成。
[0089] 然后分別用上述7條引物與ALDH2基因的共同下游引物rs671-R: 5'-cccaacagaccccaatc-3'（SEQNo·16)引物配對，加上Taqman特異性探針，加入前述構(gòu) 建所得到的野生型重組質(zhì)粒約3萬個拷貝為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行引物特異性篩 選，反應(yīng)條件設(shè)定為第一步95°C 2min預(yù)變性，95°C 5s，63°C 30s共15個循環(huán)，不收集熒 光信號，第二步95°C 5s，60°C 30s共40個循環(huán)，收集熒光信號，結(jié)果見圖1。
[0090] 其中，圖 1 中 1~7 曲線分別代表 rs671-WT-F、rs671-mut-F、rs671-mut-Fl、 rs671-mut-F2、rs671-mut-F3、rs671-mut-F4、rs671-mut-F5 的 PCR擴(kuò)增曲線，從圖 2 中我們 看出1號野生型引物在15. 5個循環(huán)產(chǎn)生擴(kuò)增信號，2-6號引物的特異性較差，分別在17-19 個循環(huán)左右產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，同野生型引物（1號）擴(kuò)增效率相差小于19個循環(huán)，第7號 引物滿足我們的要求，在40個循環(huán)時，仍然沒有擴(kuò)增，同野生型引物擴(kuò)增效率相差大于19 個循環(huán)。為了與突變引物有更好的可比性，我們參照第7號引物重新設(shè)計野生型的引物為： gggctgcaggcatacacag (SEQ No. 17)〇
[0091] 即最終設(shè)計篩選的引物： 野生型上游引物：gggctgcaggcatacacag (SEQ No. 17) 突變型上游引物：gggctgcaggcatacacaa (SEQ No