檢測(cè)豬流感病毒h3n2的引物、分子信標(biāo)探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物病原微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)豬流感病毒H3N2 的引物、分子信標(biāo)探針及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流感（swine influenza，SI)是甲型（A型）流感病毒引起的豬或人的一種急 性、人畜共患呼吸道傳染性疾病。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)流感病毒的HA有16個(gè)亞型，NA有9個(gè)亞 型，已從豬體內(nèi)分離到 H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H5N2 和 H9N2 等11種不同亞型的SIV。近幾年流行病學(xué)的研宄結(jié)果表明：我國(guó)豬群中存在H1N1、H1N2、 H3N2、H5N1和H9N2等病毒的感染，其中以H3N2和HlNl亞型流行和危害比較嚴(yán)重。流行 于世界范圍內(nèi)豬群中的H3N2亞型SI都是由類(lèi)人型H3N2亞型毒株引起的，與此同時(shí)，人 類(lèi)流感的暴發(fā)與SI的流行存在驚人的平行性和相關(guān)性，種種跡象表明，H3N2亞型SIV與 同時(shí)期引起人流感大流行的同亞型流感病毒之間遺傳關(guān)系十分緊密。因此，建立H3N2亞 型SIV的快速檢測(cè)方法不僅在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義，而且對(duì)人流感的研宄也有借鑒作 用。
[0003] 要實(shí)現(xiàn)對(duì)H3N2流感突變株快速檢測(cè)，最快捷可行的是對(duì)病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)，目 前使用最多的是熒光定量RT-PCR方法。本發(fā)明結(jié)合分子信標(biāo)技術(shù)建立豬H3N2流感的熒光 定量RT-PCR方法。不同亞型的豬流感病毒，致病性差異很大，使用傳統(tǒng)方法或不能快速、準(zhǔn) 確的檢測(cè)出疫病，或無(wú)法對(duì)病毒進(jìn)行分型。本發(fā)明結(jié)合分子信標(biāo)方法對(duì)流感病毒進(jìn)行分型， 采用該技術(shù)，即使出現(xiàn)新的流感病毒，通過(guò)改變分子信標(biāo)探針，對(duì)新的流感毒株進(jìn)行識(shí)別， 這對(duì)于流感病毒檢測(cè)功能是非常強(qiáng)大的。
[0004] 分子信標(biāo)是設(shè)計(jì)最為巧妙的探針，由一段包含了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸組成， 形成一個(gè)發(fā)夾型結(jié)構(gòu)。在其環(huán)狀部分，一般是一段長(zhǎng)度為15~30堿基的序列，能與目標(biāo)分 子特異結(jié)合，莖區(qū)是長(zhǎng)度為5~8堿基的互補(bǔ)序列，莖區(qū)的兩端分別連接有熒光基團(tuán)和淬滅 基團(tuán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)保證了分子信標(biāo)的高選擇性，只有完全互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA分子才能引 起分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)完全打開(kāi)，從而發(fā)出熒光，因此分子信標(biāo)具備高度的特異性，在檢測(cè) 快速變異的病毒時(shí)非常有優(yōu)勢(shì)，在病毒分型時(shí)也是功能強(qiáng)大的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種檢測(cè)豬流感H3N2病毒 的HA和NA基因的引物；另外提供一種檢測(cè)豬流感H3N2病毒的HA和NA基因的分子信標(biāo)探 針；以及提供一種檢測(cè)豬流感H3N2病毒的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0007] -種檢測(cè)豬流感病毒H3N2的試劑盒，包括以下組分：
[0008] 1)檢測(cè)H3NA的HA基因的引物和分子信標(biāo)探針，引物核苷酸序列如SEQ:NO: 1-2所 示；分子信標(biāo)探針核苷酸序列如SEQ:N0:5所示，該序列5'端標(biāo)記有發(fā)光的報(bào)告熒光基團(tuán) FAM，3'端標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)Dabcyle ;
[0009] 2)檢測(cè)H3NA的NA基因的引物和分子信標(biāo)探針；引物核苷酸序列如SEQ:NO: 3-4 所示；分子信標(biāo)探針核苷酸序列如SEQ:N0:6所示，該序列5'端標(biāo)記有發(fā)光的報(bào)告熒光基團(tuán) HEX，3'端標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)Dabcyle。
[0010] 上述試劑盒還包括RT-PCR反應(yīng)緩沖液、RT-PCR酶。
[0011] SEQ：N0:1 GATCCTATGGATTTCCTTTGCC
[0012] SEQ ：NO:2 CAAATGTTGCACCTAATGTTGC
[0013] SEQ ：N0:3 GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG
[0014] SEQ ： NO :4 TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC
[0015] SEQ:N0:5 5' -Fam+CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcyle-3'
[0016] SEQNO: 65' -Hex+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGC TG+Dabcyle-3'
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0018] 采用分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，克服了病毒分離操作過(guò)程繁瑣且不易 鑒定和傳統(tǒng)PCR檢測(cè)速度慢、易污染、擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)和每次檢測(cè)的樣品數(shù)量少等缺點(diǎn)， 可以對(duì)樣品中的病毒含量進(jìn)行精確的定量檢測(cè)。本發(fā)明的引物和分子信標(biāo)探針特異性高， 穩(wěn)定性好，檢測(cè)準(zhǔn)確率高，分子信標(biāo)診斷試劑盒具有檢測(cè)快速、靈敏性高、穩(wěn)定性好、易于定 量、假陽(yáng)性低等特點(diǎn)，有利于規(guī)?；妥詣?dòng)化檢測(cè)分析。
[0019] 分子信標(biāo)探針與傳統(tǒng)的TaqMan-TAMRACTaqMan-四甲基羅丹明）探針比較具有以 下優(yōu)勢(shì)：
[0020] 1.提高靈敏度：發(fā)夾結(jié)構(gòu)保證了分子信標(biāo)的高選擇性，只有完全互補(bǔ)的單鏈DNA 或RNA分子才能引起分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)完全打開(kāi)，從而發(fā)出熒光，因此它所具有的高選 擇性、高靈敏度的優(yōu)越性。
[0021] 2.提高信噪比：由于采用的非熒光染料作為淬滅分子，因此熒光本底比較低，有 效的降低了背景干擾。
[0022] 3.簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)：分子信標(biāo)探針實(shí)驗(yàn)優(yōu)化步驟簡(jiǎn)單，雜交的穩(wěn)定性大大提高，重復(fù)性 大大提尚。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1 :分子信標(biāo)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0024] 圖2 :豬流感H3N2病毒分子信標(biāo)熒光定量PCR方法敏感性實(shí)驗(yàn)；
[0025] 圖3 :豬流感H3N2病毒H3 (A)、N2 (B)基因分子信標(biāo)熒光定量PCR方法特異性實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下 實(shí)施例中，"ηΧ"（η表示數(shù)字）意為稀釋?duì)潜丁?br>[0027] 實(shí)施例中使用的生物材料及試劑說(shuō)明：
[0028] Η3Ν2毒株由哈爾濱獸醫(yī)研宄所提供；RNA抽提試劑盒購(gòu)自Promega公司； PMD18-T、反轉(zhuǎn)錄用M-MLV、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞JM109試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠 回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1)設(shè)計(jì)引物和分子信標(biāo)探針
[0031] 根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的H3N2亞型SIV的HA、NA基因核苷酸序列，利用DNA Star軟件進(jìn)行同源性分析比較，選出高度保守且特異的核苷酸區(qū)域共10段，登錄http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/進(jìn)行BLAST確定其保守性。運(yùn)用Oligo 6. 0軟件對(duì)這些保守序列 做堿基組成成分及穩(wěn)定性等方面分析，并從引物和探針設(shè)計(jì)等原則綜合考慮，最終篩選出2 段最合適的保守序列，該段保守序列位于SIV基因組的HA基因和NA基因的5'非翻譯區(qū)。 設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物H3F、H3R、N2F、N2R和2個(gè)特異分子信標(biāo)探針H3P、N2P，引物和探針 均由上海閃晶生物技術(shù)公司合成，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM和HEX，3'端標(biāo) 記的熒光淬滅基團(tuán)為4(二甲基對(duì)胺基偶氮苯）苯甲酸（DABCYL)，HA基因目的擴(kuò)增片段為 106bp，NA基因的擴(kuò)增片段為85bp。
[0032] H3F GATCCTATGGATTTCCTTTGCC H3R CAAATGTTGCACCTAATGTTGC H3 probe Fam+ CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcylc N2F GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG N2R TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC N2probc Hcx+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGCTG+Dabcylc
[0033] 2)定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建和制備
[0034] 以提取H3N2豬流感的RNA為模板，按TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3· 0試劑盒 說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以cDNA為模板，用H3F/H3R和N2F/N2R引物分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 H3F GATCCTATGGATTTCCTTTGCC H3R CAAATGTTGCACCTAATGTTGC N2F GTTATTCTGGTATnTCTCCGTTG N2R 丁CCTCTTTCCTTCCCCT「ATC
[0035] 擴(kuò)增體系如下：
[0036] cDNA IOyL
[0037] 上游引物 H3F/N2F(10yM) 2yL
[0038] 下游引物 H3R/N2R(10yM) 2yL
[0039] Mix ：25 μ L
[0040] ddH20 up to 50 μ L
[0041] 配好體系混勻后，低速離心，將液體全部置于管底，用PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增程序如下：
[0042] 94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 15sec ;60°C退火 15sec ;72°C延伸 Imin ;30 個(gè)循環(huán)后 再延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)束后在1. 5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定，將106bp和85bp處的 目的條帶切割下來(lái)，通過(guò)膠回收試劑盒（Omega公司）進(jìn)行純化，純化的目的片段與pMDlS-T 載體