一種用于制備cart細(xì)胞的具有高效轉(zhuǎn)染能力和生物學(xué)活性的慢病毒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種用于制備CART細(xì)胞的 具有高效轉(zhuǎn)染能力和生物學(xué)活性的慢病毒。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥一直是困擾人類的巨大難題，世界衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站上指出，全球每年新發(fā) 現(xiàn)腫瘤患者將每年1000萬增加到1500萬。2014年初發(fā)布的《2013中國腫瘤登記年報(bào)》顯 示，我國每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬例，平均每天8550人意味著每分鐘就有6人就診斷 為惡性腫瘤，這些數(shù)據(jù)都表明，癌癥依然是威脅健康的一大殺手。
[0003] 多年來，癌癥治療的方法主要是手術(shù)、化療和放療，對(duì)腫瘤患者的臨床治療有效率 仍舊很低，據(jù)統(tǒng)計(jì)，同一種抗腫瘤藥物的有效率僅為25%。針對(duì)同一種腫瘤，用同樣的藥、標(biāo) 準(zhǔn)劑量的治療方法，在不同病人身上所起的療效及毒副作用卻有很大的差異。造成這種結(jié) 果的主要原因在于，腫瘤是一種多病因、異質(zhì)性的疾病。過去十年來，依賴于患者個(gè)體生物 標(biāo)志物的腫瘤個(gè)性化治療正在逐漸取代依據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的治療模式，并展現(xiàn)出優(yōu)越的療效和 廣闊的前景，如伊馬替尼（Gleevec? )和曲妥珠單抗（Herceptin?:)。
[0004] 免疫療法是繼手術(shù)、化療、放療和靶向療法后出現(xiàn)的一種新型療法，被稱為治療癌 癥的"第五大療法"。它是利用患者自身免疫系統(tǒng)的力量來抵抗癌癥；癌癥免疫療法主要包 括過繼性細(xì)胞治療、免疫調(diào)節(jié)劑、腫瘤疫苗以及免疫結(jié)合點(diǎn)阻斷治療等。雖然有關(guān)免疫治療 的研宄早在30年前就已開展，最近兩年《細(xì)胞》、《科學(xué)》、《自然》等國際頂級(jí)期刊刊出多項(xiàng) 該領(lǐng)域的突破研宄成果，制藥巨頭也不斷推出此類型的重鎊療法。2014年12月6號(hào)-9號(hào) 在舊金山舉行的美國血液學(xué)會(huì)年會(huì)（ASH)上，癌癥免疫療法可謂是賺足了眼球，CAR-T療法 更是備受關(guān)注。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中的腫瘤免疫療法的缺點(diǎn)如下：
[0006] 1)操作繁瑣。目前在CAR-T治療過程中，T淋巴細(xì)胞的活化與T淋巴細(xì)胞的感染 是兩個(gè)分開的過程，需要先活化再感染。操作頻繁，而繁瑣的操作不僅僅是對(duì)人力資源的浪 費(fèi)，更重要的是，增加了對(duì)T淋巴細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)，更加會(huì)影響T淋巴細(xì)胞的狀態(tài)，而這些都 會(huì)降低CART淋巴細(xì)胞的療效，甚至?xí)?duì)CART淋巴細(xì)胞療法引入安全隱患。
[0007] 2)目前活化T淋巴細(xì)胞的方法主要是使用包被有抗體的磁珠與T淋巴細(xì)胞共培 養(yǎng)，但該方法有著如下缺陷：
[0008] 1.成本太高。包被抗體的磁珠制作繁瑣。首先需要有表達(dá)純化的抗體，其次需要 將其偶聯(lián)到磁珠。并且，整個(gè)操作過程均需要符合醫(yī)療級(jí)潔凈程度。無論是自行制作，還是 購買商業(yè)化的產(chǎn)品，成本均十分高昂。
[0009] 2.操作繁瑣。在培養(yǎng)過程中，需要先對(duì)抗體磁珠在醫(yī)療潔凈程度下進(jìn)行清洗操作， 之后才能按照比例加入到T淋巴細(xì)胞中。除了對(duì)環(huán)境要求高導(dǎo)致的成本問題，整個(gè)操作過 程也需要很多精力。
[0010] 3.活化后需將磁珠徹底去除。由于磁珠對(duì)于人體免疫系統(tǒng)來說是異物，在CART淋 巴細(xì)胞制備完成后，需要將其徹底去除。在去除過程中，需要用磁極對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，有可 能對(duì)細(xì)胞造成一定的傷害，并且會(huì)損失部分CART淋巴細(xì)胞。
[0011] 當(dāng)然，對(duì)于T淋巴細(xì)胞的活化，也有采用可溶性的抗體進(jìn)行操作?？扇苄钥贵w進(jìn)行 操作雖然沒有活化后將磁珠去除的操作，但需要得到醫(yī)療級(jí)純化的抗體，其成本也較高，操 作也繁瑣。
[0012] 感染效率偏低。CAR表達(dá)序列導(dǎo)入應(yīng)用到了多種載體，例如質(zhì)粒、體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA、慢病毒或慢病毒載體等。其中質(zhì)粒和mRNA作為載體，由于不能整合到基因組，所以不 能在T淋巴細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。相較于慢病毒，慢病毒能夠感染未分裂期的細(xì)胞，而未分裂期 T淋巴細(xì)胞的成功感染對(duì)于CART淋巴細(xì)胞的療效具有促進(jìn)作用。但是，目前常見的慢病毒 對(duì)T淋巴細(xì)胞感染效率不高，并且感染效率與T淋巴細(xì)胞的激活方案也緊密關(guān)聯(lián)。目前提 高慢病毒感染效率的解決方案，包括對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)感染、感染時(shí)離心及加入例如 Retronectin這樣的促感染試劑，但這樣的操作對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響較大，會(huì)影響細(xì)胞后續(xù)的增 殖擴(kuò)增倍數(shù)，需要特殊的儀器支持，且操作繁瑣。
[0013] 現(xiàn)有的免疫治療過程復(fù)雜、成本昂貴，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)能夠簡化 治療過程、降低治療成本的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備CART細(xì)胞的具有高效轉(zhuǎn)染能力和生物學(xué)活 性的慢病毒及其應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組病毒包膜糖蛋白，所述蛋白具有式I所述結(jié) 構(gòu)：
[0016] N 端' B-A C 端' （I)
[0017] 其中，
[0018] 元件A為衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；
[0019] 元件B為輔助蛋白元件，并且所述輔助蛋白元件可特異性識(shí)別與T細(xì)胞活化相關(guān) 的T細(xì)胞細(xì)胞膜表面蛋白；
[0020] 表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述野生型病毒包膜糖蛋白選自：VSV、BaEv、RD114、MLVjPMV。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A為VSVG (水皰口炎病毒糖蛋白）。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，優(yōu)選地，所述元 件A的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述與T細(xì)胞活化相關(guān)的T細(xì)胞細(xì)胞膜表面蛋白選自：CD3、 CD28〇
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B選自：抗體（包括但不限于單克隆抗體、納米抗體、單 鏈抗體）、及其活性片段。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B選自下組：抗⑶3的單鏈抗體、抗⑶28的單鏈抗體。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B的序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所示。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、或SEQ ID NO. : 5所示。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述重組病毒包膜糖蛋白選自下組：
[0030] (A)具有SEQ ID NO: 17、19所示氨基酸序列的多肽；
[0031] (B)具有與SEQ ID NO: 17、19所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡90%的 同源性；等優(yōu)選地多95 %的同源性；最優(yōu)選地，多97 %的同源性，如98 %以上，99 %以上） 的多肽，且所述多肽具有與（A)中多肽相似的活性；
[0032] (C)將（A)中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的，且保留（A)中多肽活性的衍生多肽。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述重組病毒包膜糖蛋白具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特性：
[0034] a)具有特異性識(shí)別與T細(xì)胞活化相關(guān)的T細(xì)胞細(xì)胞膜表面蛋白的活性；
[0035] b)具有促進(jìn)T細(xì)胞活化的活性；
[0036] c)具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖的活性。
[0037] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第 一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白。
[0038] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為質(zhì)粒。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為慢病毒載體、腺病毒載體、或腺相關(guān)病毒載體。
[0041] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種基因工程化的重組病毒，所述病毒具有本發(fā)明第 一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒為慢病毒、腺病毒、或腺相關(guān)病毒。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒的基因組中具有外源的基因。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述外源的基因表達(dá)CAR(嵌合抗原受體）。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒具有至少兩種本發(fā)明第一方面所述的重組病毒包膜糖 蛋白（具有相同的元件A和不同的元件B)。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒的包膜糖蛋白中具有SEQ ID NO: 17、和SEQ ID NO. : 19 所示的氨基酸序列的多肽。
[0047] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明第三方面所述的載體或 基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞（如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、 或293細(xì)胞）。
[0049] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明第一方面所述 的重組病毒包膜糖蛋白、本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體、本 發(fā)明第四方面所述的病毒、和/或本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中包括編碼權(quán)利要求1中所述重組病毒包膜糖蛋白 的載體；和，野生型載體，所述野生型載體編碼與所述重組病毒包膜糖蛋白相對(duì)應(yīng)的野生型 病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0051] 本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白、本發(fā)明 第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包 裝。
[0052] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種重組病毒的包裝方法，所述方法包括步驟：
[0053] (1)提供一包裝細(xì)胞；
[0054] (2)配制轉(zhuǎn)染體系，所述轉(zhuǎn)染體系中包括表達(dá)權(quán)利要求1所述的重組病毒包膜糖 蛋白的載體；和
[0055] (3)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，所述轉(zhuǎn)染體系包括至少兩種表達(dá)不同的重組 病毒包膜糖蛋白的重組型載體；優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染體系中還包括野生型載體，所述野生型載 體編碼與所述重組病毒包膜糖蛋白相對(duì)應(yīng)的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述重組型載體為α⑶3-VSVG，和/或α⑶28-VSVG ;所述野生 型載體為野生型載體Η2。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)所述轉(zhuǎn)染體系中包括重組型載體α⑶3-VSVG，和 α⑶28-VSVG ;以及野生型載體Η2 ;優(yōu)選地，所述重組型載體與所述野生型載體的數(shù)量比為 7 :3-6〇
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述重組型載體中a CD3-VSVG : a CD28-VSVG為I : 1。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述包裝細(xì)胞為ΗΕΚ-293Τ細(xì)胞。
[0061] 本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第四方面所述的重組病毒在制備CAR-T細(xì)胞中 的用途。
[0062] 本發(fā)明的第十方面，提供了一種制劑，所述制劑含有本發(fā)明第四方面所述的重組 病毒和任選的賦形劑。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑為藥物制劑。
[0064] 在另一優(yōu)選例中，所述的賦形劑為藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0065] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0066] 圖1顯示了野生型Η2質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0067] 圖2顯示了經(jīng)重組的α⑶3 - VSVG質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0068] 圖3顯示了經(jīng)重組的α⑶28-VSVG質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0069] 圖4中A圖顯示了轉(zhuǎn)染體系中不同類型Η2質(zhì)粒配比對(duì)病毒產(chǎn)量的影響，B圖顯示 了成功表達(dá)的病毒顆粒的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。
[0070] 圖5顯示了本發(fā)明中經(jīng)改造的慢病毒對(duì)T細(xì)胞的感染效率的檢測(cè)結(jié)果。
[0071] 圖6顯示了本發(fā)明中經(jīng)改造的慢病毒對(duì)T細(xì)胞活化的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0072] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研宄，獲得一種新型的重組慢病毒設(shè)計(jì)方案，通過對(duì) 其包膜進(jìn)行修飾，該慢病毒可作為CAR-T淋巴細(xì)胞治療中的外源基因的載體，可以更高的 效率感染T淋巴細(xì)胞，將外源基因?qū)氲絋淋巴細(xì)胞中，從而對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因組修 飾，而且在此過程中同時(shí)起到對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的作用，極大的簡化了腫瘤免疫治療的過 程。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0073] 在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@ 類方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并 且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。
[0074] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù) 語"約"意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1%。例如，如本文所用，表述"約100"包括 99和101和之間的全部值（例如，99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0075] 雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法 和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0076] CAR-T淋巴細(xì)胞療法
[0077] CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，SP嵌合抗原受體 T 淋巴細(xì)胞免疫療法。
[0078] 嵌合抗原受體：人工設(shè)計(jì)的蛋白片段，包括胞外片段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)片段三部分組 成。胞外片段可以對(duì)腫瘤細(xì)胞特定的膜蛋白進(jìn)行識(shí)別，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的 定位及殺傷。胞內(nèi)段可以提供共刺激信號(hào)，增強(qiáng)細(xì)胞的殺傷能力，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的存活。
[0079] CAR-T淋巴細(xì)胞治療的原理在于經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，可以特異性 地識(shí)別腫瘤特異的抗原，使效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的靶向性、殺傷性、持久性以及細(xì)胞因子的分泌 均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細(xì)胞高。同時(shí)可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境并打破宿主免疫耐受狀 態(tài)，即表達(dá)CAR的T淋巴細(xì)胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原，啟動(dòng)并活化特 異性殺傷腫瘤反應(yīng)。
[0080] CAR-T淋巴細(xì)胞制備包括以下流程：
[0081] 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)/T淋巴細(xì)胞分離一一T淋巴細(xì)胞活化一一CAR表達(dá)序