米曲霉菌株及其在豆醬發(fā)酵中的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】
[0001](一)技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株米曲霉(Aspergillusoryzae)Zff2-1及其在豆醬發(fā)酵中的應(yīng)用。
[0002]( 二)【背景技術(shù)】:豆醬是我國(guó)傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵豆制品，以其獨(dú)特的工藝，細(xì)膩的品質(zhì)，豐富的營(yíng)養(yǎng)，鮮香可口的風(fēng)味而深受廣大群眾的喜愛(ài)，有良好的市場(chǎng)前景，因而提高豆醬的質(zhì)量對(duì)人類的健康具有重要的意義。米曲霉是豆醬發(fā)酵中常用的菌株，在生產(chǎn)過(guò)程中，米曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等把原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素分別水解產(chǎn)生氨基酸、糖類等物質(zhì)，因此，生產(chǎn)用菌株的酶系分布及活性對(duì)豆醬生產(chǎn)中原料氮利用率和風(fēng)味起著決定性的作用。
[0003]目前在豆醬的生產(chǎn)過(guò)程中也存在影響產(chǎn)品品質(zhì)的不穩(wěn)定因素。如菌株酶系的活力及各組分的協(xié)調(diào)性對(duì)品質(zhì)的影響，多關(guān)注蛋白酶活力大小而忽視其它酶系；“白點(diǎn)”問(wèn)題是豆醬產(chǎn)品中最常見(jiàn)的負(fù)面感官因子，其雖不影響產(chǎn)品的風(fēng)味與口感，但影響豆醬的感官品質(zhì)和消費(fèi)者的購(gòu)買欲，對(duì)豆醬產(chǎn)品的銷售不利。已有研宄表明，添加乳化劑、抑菌劑，或控制發(fā)酵工藝條件、生產(chǎn)操作等措施可部分減輕“白點(diǎn)”的形成，但是也可能引入一些安全問(wèn)題，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且產(chǎn)品質(zhì)量不容易控制。有研宄表明，“白點(diǎn)”的形成是由酪氨酸結(jié)晶析出的，而酪氨酸羧肽酶是發(fā)酵過(guò)程中酪氨酸產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明酪氨酸含量低于6.15mg/g干基時(shí)，豆醬成品中沒(méi)有“白點(diǎn)”出現(xiàn)。因此最根本的解決方法是從菌種角度出發(fā)，通過(guò)馴化選育酪氨酸羧肽酶活性低的菌株進(jìn)行發(fā)酵，以減少酪氨酸的生成，解決豆醬中存在的“白點(diǎn)”問(wèn)題。本發(fā)明篩選出一株生長(zhǎng)旺盛、產(chǎn)孢豐富、酶活性高且各組份活力平衡性好、酪氨酸羧肽酶活性低的、安全優(yōu)質(zhì)米曲霉菌株，其不僅能提高原材料的利用率、產(chǎn)品出品率，而且能縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本，提高豆醬的風(fēng)味和品質(zhì)，解決“白點(diǎn)”的產(chǎn)生，對(duì)于提尚發(fā)酵調(diào)味品的質(zhì)量和品質(zhì)具有?米遠(yuǎn)的意義。
[0004](三)
【發(fā)明內(nèi)容】
:本發(fā)明的目的是提供一株適合優(yōu)質(zhì)豆醬生產(chǎn)的米曲霉菌株，提高提高原材料利用率，降低生產(chǎn)成本，提高豆醬的風(fēng)味和品質(zhì)，防止“白點(diǎn)”的產(chǎn)生。
[0005]本發(fā)明所提供的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1，根據(jù)對(duì)其平板菌落形態(tài)和分生孢子頭形態(tài)特征觀察，及ITS序列比對(duì)分析，鑒定該菌株為米曲霉(Aspergillusoryzae)，命名為米曲霉 ZW2-1 (Aspergillus oryzae ZW2-1)，該菌株已于 2014 年 11 月 13日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2014565，地址:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。
[0006]本發(fā)明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZW2_l，生長(zhǎng)溫度范圍寬，在25-38°C范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)快。其中，30°C條件下產(chǎn)酶活性最高。
[0007]本發(fā)明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1，其形態(tài)學(xué)特征如下:
[0008]在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上:菌株ZW2-1生長(zhǎng)較快，280C 7天直徑可達(dá)76_80mm，基本布滿整個(gè)平板，質(zhì)地緊密呈絮狀，菌落中央最先出現(xiàn)白色，培養(yǎng)2d左右菌落中央開(kāi)始產(chǎn)生孢子并逐漸向外蔓延，顏色初為橄欖綠色，后逐漸呈黃綠色至綠色，無(wú)滲出液，菌落反面呈淺乳黃色(圖1)。真菌濕室培養(yǎng)后，在微分干涉顯微鏡下觀察該菌株自然狀態(tài)下的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明該菌株菌絲發(fā)達(dá)、透明、有隔膜、足細(xì)胞，分生孢子頭初為球形，后呈輻射形，分生孢子梗有的生自基質(zhì)，有的生于氣生菌絲，壁粗糙，頂囊呈球形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，分生孢子球形(圖4)。
[0009]在察氏培養(yǎng)基上:菌株ZW2-1生長(zhǎng)較緩慢，28°C 7天直徑可達(dá)50_60臟，質(zhì)地絲絨狀，菌落層厚，菌落初期為白色，隨著菌落的生長(zhǎng)，中心先形成黃綠色的孢子，后逐漸向外延伸，菌落生長(zhǎng)緊密，具不規(guī)則的輻射狀條紋，無(wú)滲出液，菌落反面呈淡紅色(圖2)。
[0010]在察氏酵母膏培養(yǎng)基上:菌株ZW2-1生長(zhǎng)與在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上相似，28°C 7天直徑可達(dá)80-84mm，可布滿整個(gè)平板，菌落層厚，中間向上凸起，質(zhì)地絲絨狀，生長(zhǎng)致密，孢子形成較慢，呈淡黃綠色，菌落反面淡粉紅色(圖3)。
[0011]本發(fā)明所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae) ZW2_1，其ITS序列由558個(gè)堿基(bp)組成，基因序列如下:
[0012]GGGCTACGAGCGTAGGATCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
[0013]應(yīng)用米曲霉菌株ZW2-1進(jìn)行制曲、發(fā)酵，制得的種曲色澤鮮艷，孢子著生好，數(shù)量多，可達(dá)9*101(1個(gè)/g干基，結(jié)塊好，酶活力高且各組份活力平衡好，可有效地降解原料中的蛋白質(zhì)和糖類，從而提高醬類制品的風(fēng)味和品質(zhì)；酪氨酸羧肽酶活性低，豆醬發(fā)酵過(guò)程中酪氨酸產(chǎn)生量低，可避免由于酪氨酸含量高而結(jié)晶析出產(chǎn)生“白點(diǎn)”。在保證產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí)，可有效防止“白點(diǎn)”的廣生，對(duì)于提尚發(fā)酵調(diào)味品的質(zhì)量和品質(zhì)具有?米遠(yuǎn)的意義。
[0014]本發(fā)明取得以下有益效果:
[0015]菌株(Aspergillus oryzae) ZW2-1生長(zhǎng)溫度范圍寬，25_38°C范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好；不產(chǎn)黃曲霉毒素，安全無(wú)害；制曲過(guò)程中生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢豐富，可縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效益。制得的種曲色澤鮮綠，孢子著生好，結(jié)塊好，酶活力高且各組份活力平衡性好，可有效地降解原料中的蛋白質(zhì)和糖類，酪氨酸羧肽酶活性低，可在保證產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí)，有效防止“白點(diǎn)”的產(chǎn)生，從而提高醬類制品的風(fēng)味和品質(zhì)。將本發(fā)明提供的米曲霉菌株運(yùn)用于醬類等發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，對(duì)于降低生產(chǎn)成本、提高發(fā)酵調(diào)味品的質(zhì)量和品質(zhì)具有深遠(yuǎn)的意義。
(四)【附圖說(shuō)明】:
[0016]圖1為菌株ZW2-1在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖
[0017]圖2為菌株ZW2-1在察氏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖
[0018]圖3為菌株ZW2-1在察氏酵母膏培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖
[0019]圖4為菌株ZW2-1在微分干涉顯微鏡下的分生孢子圖
[0020]圖5為菌株ZW2-1的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
(五)具體實(shí)施方案:
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，培養(yǎng)基定容均為水。
[0022]實(shí)施例1
[0023]米曲霉菌株(Aspergillusoryzae) Zff2-1 CCTCC N0.M 2014565 的分離、鑒定與保藏
[0024]—、米曲霉菌株的分離純化
[0025]1、材料準(zhǔn)備
[0026]樣品來(lái)源:浙江五味和食品有限公司生產(chǎn)車間。
[0027]馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基:市購(gòu)的馬鈴薯去皮后切成Icm2見(jiàn)方的小塊，稱取200g馬鈴薯塊，加5-6倍水，文火煮沸半個(gè)小時(shí)，用八層紗布過(guò)濾后，加蔗糖20g，瓊脂20g，定容至1000ml，121°C 滅菌 20min。
[0028]察氏培養(yǎng)基:蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g, MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.0lg，酵母浸提物5g，瓊脂15-20g，定容至1000ml，121°C滅菌20min。
[0029]察氏酵母膏培養(yǎng)基:蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.0lg，瓊脂 15-20g，定容至 1000ml，121°C滅菌 20min。
[0030]小室培養(yǎng):取干熱滅菌的載玻片，在其上滴一小滴馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)基上蓋一個(gè)無(wú)菌蓋玻片，使蓋玻片與載玻片之間的距離剛好容納單層菌株生長(zhǎng)；制好的載玻片培養(yǎng)基置于無(wú)菌的含有20 %甘油的平皿中，組成小室培養(yǎng)。
[0031]2、米曲霉菌株的分離
[0032]樣品取Ig到1ml無(wú)菌生理鹽水中，在渦旋振蕩器上把孢子充分分散在水中制成孢子懸液，然后依次取Iml孢子懸液到9ml無(wú)菌水中，經(jīng)梯度稀釋，各個(gè)稀釋梯度的孢子懸液均用渦旋振蕩器分散均勻，各取200 μ I孢子懸液涂布于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行，28°C條件下恒溫培養(yǎng)3天左右，得到不同的菌落。
[0033]挑取形態(tài)不同的菌落點(diǎn)接于馬