一種切梢小蠹伴生菌野外分離法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及切梢小蠹伴生菌分離方法技術(shù)領(lǐng)域，屬于森林病蟲害防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]切梢小蠹是以松樹為主的針葉樹鉆蛀性害蟲，迄今已經(jīng)描述的有7種，主要有縱坑切梢小蠹(Tomicus piniperda)、橫坑切梢小蠹(J.minor)、云南切梢小蠹(T.JTOzaaflefl1Si1S)、松芽切梢小蠹、Τ.brevipilosus)和華山松切梢小蠹、T.armandii)等。其中，橫坑切梢小蠹和華山松切梢小蠹是目前我國(guó)主要松樹害蟲，特別是上世紀(jì)80年代以來(lái)，這些切梢小蠹在云南松林區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，導(dǎo)致近百萬(wàn)畝云南松林完全毀滅。進(jìn)入本世紀(jì)以來(lái)，切梢小蠹災(zāi)害仍持續(xù)保持高位，在以云南為主的整個(gè)西南云南松林區(qū)，每年危害面積仍在150萬(wàn)畝以上，給當(dāng)?shù)亓謽I(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。
[0003]切梢小蠹在蛀害松樹過程中常常將病原真菌帶入樹木韌皮部，該病原菌因與切梢小蠹具有較為緊密的生態(tài)學(xué)聯(lián)系，且往往由切梢小蠹所攜帶，故又稱之為切梢小蠹伴生菌。其菌絲體在樹木韌皮部及木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)，并將受害部位韌皮組織和木質(zhì)部染成藍(lán)色。研宄表明，切梢小蠹伴生菌對(duì)于削弱寄主樹木抗性、協(xié)助切梢小蠹侵害具有積極協(xié)同和促進(jìn)作用。因此，切梢小蠹伴生菌研宄，對(duì)探索切梢小蠹與其伴生菌的生態(tài)學(xué)關(guān)系，全面闡釋切梢小蠹危害成災(zāi)機(jī)制均具有重要意義。
[0004]切梢小蠹在寄主樹木內(nèi)的蛀食活動(dòng)將在樹木韌皮組織內(nèi)留下蛀食坑道，由切梢小蠹雌蟲蛀食所留下坑道稱為母坑道，由切梢小蠹幼蟲蛀食所留下的坑道稱為子坑道。由于切梢小蠹伴生菌是由切梢小蠹所攜帶，伴隨其蛀食過程而傳播，因而切梢小蠹伴生菌主要從切梢小蠹母坑道入侵，首先在切梢小蠹母坑道發(fā)育形成。為此，切梢小蠹母坑道是確定并分離切梢小蠹伴生菌的理想場(chǎng)所，同時(shí)，切梢小蠹伴生菌也會(huì)在子坑道中出現(xiàn)，某些情況下母坑道中的伴生菌受其它類型真菌影響不易分離時(shí)可從子坑道入手，因此查找伴生菌時(shí)需對(duì)切梢小蠹各蛀食坑道逐一檢查。
[0005]切梢小蠹伴生菌分離是切梢小蠹伴生菌研宄的基礎(chǔ)。在過去，分離切梢小蠹伴生菌的方法大體上是到切梢小蠹發(fā)生林區(qū)，砍伐被切梢小蠹為害的樹木，將受害樹木木段或受害韌皮組織、藍(lán)變組織等帶回實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行伴生菌分離。該分離方法存在木段運(yùn)輸工作量大、采樣組織保存時(shí)間不長(zhǎng)、分離時(shí)間周期長(zhǎng)、污染率高、分離效率低等不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)存在采樣和分離工作量大、污染率高和分離周期長(zhǎng)等問題，提出一種可有效降低污染率和節(jié)省分離時(shí)間、顯著提高小蠹蟲伴生菌分離效率的切梢小蠹伴生菌野外分離法。
[0007]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種切梢小蠹伴生菌野外分離法，該方法為先確定林內(nèi)受害松樹上切梢小蠹侵入孔，以侵入孔為起點(diǎn)沿切梢小蠹蟲母坑道方向，剝?nèi)デ猩倚◇枷x母坑道表面樹皮，露出切梢小蠹蛀食母坑道韌皮組織，若母坑道兩側(cè)已形成子坑道，則將其一并露出，檢查確證切梢小蠹各坑道內(nèi)是否存在切梢小蠹伴生菌孢子、菌絲、子囊殼以及藍(lán)變韌皮組織，根據(jù)切梢小蠹伴生菌生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)度及藍(lán)變韌皮組織情況，采取對(duì)應(yīng)的切梢小蠹伴生菌分離措施，具體的對(duì)應(yīng)措施包括有:
1)如果發(fā)現(xiàn)切梢小蠹蛀食坑道內(nèi)黑色成熟子囊殼頂端著生白色或透明、半透明伴生菌孢子，即用滅菌細(xì)竹簽挑取單個(gè)孢子在2%MEA上培養(yǎng)；
2)如果坑道中僅發(fā)現(xiàn)深灰色菌絲或不成熟子囊殼，則切割下小薄段帶有坑道的韌皮組織于加保濕棉層的自封袋中培養(yǎng)3~7天，待坑道內(nèi)長(zhǎng)出孢子再挑取到2% MEA培養(yǎng)基上；
3)如果只發(fā)現(xiàn)藍(lán)變的韌皮組織，則用75%酒精在韌皮部進(jìn)行表面消毒后剝離外層藍(lán)變組織，取小薄片內(nèi)部藍(lán)變組織插入2% MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1)直接在林中受害樹木上挑取切梢小蠹坑道內(nèi)著生在韌皮組織表面的伴生菌孢子，簡(jiǎn)化了過去切梢小蠹伴生菌采集和分離的繁瑣步驟，簡(jiǎn)便易行；
2)當(dāng)切梢小蠹坑道中只有菌絲或不成熟子囊殼時(shí)，將該坑道韌皮組織切成小塊，放入加有保濕棉層的塑料自封袋中，在室溫條件下培養(yǎng)3~7天，即可獲得切梢小蠹伴生菌。免除了過去實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用大量玻璃培養(yǎng)皿等器具，野外伴生菌采樣需要攜帶電鋸，以及受害木段運(yùn)輸?shù)却罅抗ぷ鳎?br> 3)將藍(lán)變組織用酒精擦拭局部消毒后，剝離外層組織，直接用藍(lán)變內(nèi)部韌皮組織進(jìn)行伴生菌培養(yǎng)，可減少藍(lán)變外層韌皮組織上的雜菌污染。
[0009]本發(fā)明直接在野外對(duì)切梢小蠹伴生菌孢子、菌絲或子囊殼或已經(jīng)藍(lán)變的韌皮組織進(jìn)行伴生菌采集分離，針對(duì)性強(qiáng)，將伴生菌的采集和分離同步進(jìn)行，可有效降低污染率和節(jié)省分離時(shí)間。
【具體實(shí)施方式】
[0010]一種切梢小蠹伴生菌野外分離法，具體步驟如下:
野外采樣前準(zhǔn)備一個(gè)小型輕質(zhì)手提箱或背包，準(zhǔn)備小砍刀或斧頭，便攜式100倍帶燈放大鏡，封口膜，裝有酒精棉團(tuán)的小瓶，若干配有2%麥芽瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基(即2%MEA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的百分比為質(zhì)量百分比，配比為每100ml蒸餾水加20g麥芽提取粉和20g瓊月旨)的小型一次性塑料培養(yǎng)皿，建議直徑為35_和直徑60_，裝有保濕棉花層的4號(hào)自封袋，滅菌手術(shù)刀片、小鑷子和細(xì)竹簽，數(shù)量可根據(jù)具體采樣點(diǎn)和采樣周期酌情準(zhǔn)備。
[0011]在云南松、思茅松和華山松等分布密集的林區(qū)松樹上首先確定切梢小蠹侵入孔，以侵入孔為起點(diǎn)沿切梢小蠹蟲母坑道方向，剝?nèi)デ猩倚◇枷x母坑道表面樹皮，露出切梢小蠹蛀食母坑道韌皮組織，若母坑道兩側(cè)已形成子坑道，則將其一并露出，用便攜式100倍放大鏡觀察各蛀食坑道內(nèi)是否已有切梢小蠹伴生菌孢子、菌絲或子囊殼。如果發(fā)現(xiàn)坑道內(nèi)黑色成熟子囊殼頂端著生白色或透明、半透明伴生菌孢子，用滅菌細(xì)竹簽挑取孢子在2% MEA培養(yǎng)基上(培養(yǎng)皿直徑可為35mm)，并用封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣；如果坑道中只有深灰色菌絲或不成熟子囊殼，則用手術(shù)刀切割一小段長(zhǎng)4~5cm、寬2~2.5cm、厚l~2mm的帶坑道韌皮組織于加保濕棉層的4號(hào)自封袋中培養(yǎng)3-7天，待坑道內(nèi)長(zhǎng)出孢子再挑取到2% MEA培養(yǎng)基上；如果只發(fā)現(xiàn)藍(lán)變的韌皮組織，則用75%酒精在韌皮部進(jìn)行表面消毒后用尖頭小鑷子剝離外層藍(lán)變組織，取長(zhǎng)3~5mm，寬2~3cmm，厚0.5~lmm的內(nèi)部組織2~3片插于2% MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)(培養(yǎng)皿可為直徑60_)，用封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣。采樣后回實(shí)驗(yàn)室，將培養(yǎng)皿放置于25°C條件下，7~10天可觀察到目標(biāo)菌落形成，如有污染，則挑取其菌落邊緣菌絲于2%MEA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)10~15天可獲得單菌落。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種切梢小蠹伴生菌野外分離法，其特征在于，該方法先確定林內(nèi)受害松樹上切梢小蠹侵入孔，以侵入孔為起點(diǎn)沿切梢小蠹蟲母坑道方向，剝?nèi)デ猩倚◇枷x母坑道表面樹皮，露出切梢小蠹蛀食母坑道韌皮組織，若母坑道兩側(cè)已形成子坑道，則將其一并露出，檢查確證切梢小蠹各坑道內(nèi)是否存在切梢小蠹伴生菌孢子、菌絲、子囊殼以及藍(lán)變韌皮組織，根據(jù)切梢小蠹伴生菌生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)度及藍(lán)變韌皮組織情況，采取對(duì)應(yīng)的切梢小蠹伴生菌分離措施，具體的對(duì)應(yīng)措施包括有: 1)如果發(fā)現(xiàn)切梢小蠹蛀食坑道內(nèi)黑色成熟子囊殼頂端著生白色或透明、半透明伴生菌孢子，即用滅菌細(xì)竹簽挑取單個(gè)孢子在2% MEA上培養(yǎng)； 2)如果坑道中僅發(fā)現(xiàn)深灰色菌絲或不成熟子囊殼，則切割下小薄段帶有坑道的韌皮組織于加保濕棉層的自封袋中培養(yǎng)3~7天，待坑道內(nèi)長(zhǎng)出孢子再挑取到2% MEA培養(yǎng)基上； 3)如果只發(fā)現(xiàn)藍(lán)變的韌皮組織，則用75%酒精在韌皮部進(jìn)行表面消毒后剝離外層藍(lán)變組織，取小薄片內(nèi)部藍(lán)變組織插入2% MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
【專利摘要】一種切梢小蠹伴生菌野外分離法，該方法先確定林內(nèi)受害松樹上切梢小蠹侵入孔，以侵入孔為起點(diǎn)沿切梢小蠹蟲母坑道方向，剝?nèi)デ猩倚◇枷x母坑道表面樹皮，露出切梢小蠹蛀食母坑道韌皮組織，若母坑道兩側(cè)已形成子坑道，則將其一并露出，檢查確證切梢小蠹各蛀食坑道內(nèi)是否存在切梢小蠹伴生菌孢子、菌絲、子囊殼以及藍(lán)變韌皮組織，根據(jù)切梢小蠹伴生菌生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)度及藍(lán)變韌皮組織情況，采取對(duì)應(yīng)的切梢小蠹伴生菌分離措施。本發(fā)明將野外采樣和實(shí)驗(yàn)室菌種分離合二為一，步驟簡(jiǎn)單，操作方便，切梢小蠹伴生菌分離獲取成功率高，有效簡(jiǎn)化了過去通過先將受伴生菌感染木段或帶坑道韌皮、藍(lán)變組織帶回實(shí)驗(yàn)室，再進(jìn)行分離的諸多環(huán)節(jié)，節(jié)省伴生菌分離時(shí)間，精準(zhǔn)分離并提高分離效率。
【IPC分類】C12N1/14
【公開號(hào)】CN104911112
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510361389
【發(fā)明人】葉輝, 潘悅, 周旭東, 呂軍, 陳鵬, 陸紅葉, 朱玲玲
【申請(qǐng)人】云南大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月28日