一種根瘤菌及其菌劑和制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種根瘤菌及其菌劑和制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中隨著化肥的大量施用，農(nóng)作物的產(chǎn)值、產(chǎn)量都有了很大的提高，同 時(shí)也導(dǎo)致了土壤有機(jī)質(zhì)降低、土壤板結(jié)、土地生產(chǎn)力下降等一系列問題。土壤微生物具有促 進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、活化土壤養(yǎng)分、增加養(yǎng)分供應(yīng)的作用。土壤微生物參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的各 種生物化學(xué)反應(yīng)，與土壤養(yǎng)分的供應(yīng)和損失密切相關(guān)。在土壤中，有機(jī)質(zhì)礦化與腐殖化、氮 素的硝化和反硝化、含磷鉀礦物的有效化等過程均有土壤微生物的參與，土壤微生物制約 著土壤氮、磷、鉀營養(yǎng)元素的供應(yīng)和生物有效性，影響煙株的產(chǎn)、質(zhì)量。而土壤養(yǎng)分大部分以 無效態(tài)存在，氮大部分為有機(jī)氮，含磷和含鉀礦物占土壤全磷鉀的95%以上。有機(jī)氮在微生 物的作用下礦化為無機(jī)氮，供給植物營養(yǎng)；土壤中的溶磷解鉀微生物能分泌甲酸、乙酸、草 酸、檸檬酸、丁二酸等，溶解含磷和含鉀礦物，釋放磷鉀，提高它們的生物有效性，改善作物 營養(yǎng)。在土壤中，存在共生固氮菌、自生固氮菌和聯(lián)合固氮菌等多種固氮微生物，通過不同 方式固定空氣中的氮，增加土壤的氮素養(yǎng)分，供給植物營養(yǎng)之需要。而一種微生物具有多種 作用的菌劑未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明第一目的在于提供一種根瘤菌，第二目的在于提供一種以所述根瘤菌作為 活性成分的菌劑，第三目的在于提供所述以根瘤菌作為活性成分的菌劑制備方法，第四目 的在于提供所述菌劑的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的根瘤菌為放射根瘤菌 A32,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2014年 11月21日，保藏編號：CGMCC No. 10031 ;所述根瘤菌屬于細(xì)菌界，變形菌門，α -變形菌綱， 根瘤菌目，根瘤菌科，根瘤菌屬。
[0005] --放射根瘤菌（Λ rat/ioAacier) Α32的獲得與鑒定 (1)放射根瘤菌（紀(jì)ier) A32的獲得與鑒定 本發(fā)明所述的放射根瘤菌，是采用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基從楚雄市東華鎮(zhèn)煙田的紫色土壤 中分離出來，在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上選擇菌落透明、發(fā)亮、粘性較大的菌落再轉(zhuǎn)接到無機(jī)磷 細(xì)菌培養(yǎng)基上，出現(xiàn)溶磷圈后，記錄菌落直徑和溶磷圈大小，取溶磷圈較大的菌重新純化培 養(yǎng)，再挑到40%的滅菌干油管中4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0006] 所用培養(yǎng)基配方： 1、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基： 蔗糖 5g、土壤礦物 I. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 5g、CaCO3 0· lg、Na2HPO4 2. 0g、FeCl3 (1%) 0.21111、瓊脂2(^、蒸餾水 10001111邛!17.0~7.5。
[0007] 2、無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基： 葡萄糖 10 g、（NH4)2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgS04.7H20 0.3g、FeS04.7H20 0.03g、MnSO4 ·4Η20 0.03 g、CaCO3 5 g、Ca3(PO4)2 10g、瓊脂 18-20g、蒸餾水 1000ml、pH 7. 0~7. 5 〇
[0008] 對上述分離的菌株A32,通過常規(guī)方法進(jìn)行生物學(xué)和生理生化特性檢測與分子生 物學(xué)方法鑒定。分子鑒定方法如下：細(xì)菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0,方法參見試劑盒說明書。PCR擴(kuò)增選用引物F27/ R1492,常規(guī)條件擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。
[0009] 該菌呈桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性，葡萄糖發(fā)酵陰性，接觸酶陽性，氧化酶陽 性，甲基紅試驗(yàn)陰性，VP試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原陽性.。
[0010] 16S rDNA序列分析：通過序列比對和生理生化特性將A32菌株鑒定為放射根瘤菌 (TP. radiobacter)。
[0011] (2 )放射根瘤菌（TP. rat/ioAac ier) A3 2 的保藏 通過上述鑒定結(jié)果，確認(rèn)菌株A32為放射根瘤菌（TP. 的一個(gè)株系，命 名為A32,于2014年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編 100101)，其保藏編號為 CGMCC No. 10031。
[0012] 本發(fā)明第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，是以所述放射根瘤菌rat/io知cier) A32經(jīng)平 板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后制成的菌劑。
[0013] 本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵、菌劑制備步驟， 具體包括： A、 平板培養(yǎng)：將放射根瘤菌接種到平板培養(yǎng)基上，在溫度為 26~30°C下培養(yǎng)48~54h，得平板菌種； B、 種子培養(yǎng)：將平板菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度為26~30°C下?lián)u床上培養(yǎng) 48~54h，得液體發(fā)酵種子； C、 發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積8~12%的量接種入發(fā)酵罐，在28~32°C下培 養(yǎng)36~54h，攪拌速度為170~190 r/min，通氣量60~100%，得到放射根瘤菌A32發(fā)酵液； D、 菌劑制備：在發(fā)酵液中加入吸附劑吸附經(jīng)風(fēng)干至水分含量重量比小于13%得到目標(biāo) 固體菌劑。
[0014] 本發(fā)明第四目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述菌劑直接施用于土壤，起到解磷、解鉀、提高 速效氮的作用。
[0015] 除非另有說明外，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
[0016] 本發(fā)明所述放射根瘤菌和以所述放射根瘤菌為活性成分的制劑的優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明所用的放射根瘤菌具有將土壤中難溶的無機(jī)磷、鉀分解成植物易于吸收的磷、 鉀的功能，同時(shí)提高土壤中全氮的含量。施用放射根瘤菌菌劑后可以促進(jìn)土壤直接釋放不 被植物吸收的氮、磷、鉀養(yǎng)分，可以適當(dāng)降低無機(jī)氮、磷、鉀肥料的施入；同時(shí)該菌是從煙田 土壤中分離得到的，通過增殖培養(yǎng)后再以有機(jī)肥的形式施入田間，對植煙土壤環(huán)境改良具 有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基 于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 本發(fā)明所述的根瘤菌為放射根瘤菌（Λ A32,保藏單位：中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2014年11月21日，保藏編號： CGMCCNo. 10031;所述根瘤菌屬于細(xì)菌界，變形菌門，α-變形菌綱，根瘤菌目，根瘤菌科， 根瘤菌屬。
[0020] 本發(fā)明所述的根瘤菌為活性成分的菌劑，是以放射根瘤菌Α32 經(jīng)平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后制成的菌劑。
[0021] 本發(fā)明所述的根瘤菌為活性成分的菌劑的制備方法，包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā) 酵、菌劑制備步驟，具體包括： A、 平板培養(yǎng)：將放射根瘤菌接種到平板培養(yǎng)基上，在溫度為 26~30°C下培養(yǎng)48~54h，得平板菌種； B、 種子培養(yǎng)：將平板菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度為26~30°C下?lián)u床上培養(yǎng) 48~60h，得液體發(fā)酵種子； C、 發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積8~12%的量接種入發(fā)酵罐，在28~32°C下培 養(yǎng)36~54h，攪拌速度為170~190 r/min，通氣量60~100%，得到放射根瘤菌A32發(fā)酵液； D、 菌劑制備：在發(fā)酵液中加入吸附劑吸附經(jīng)風(fēng)干至水分含量重量比小于13%得到目標(biāo) 固體菌劑。
[0022] 所述的平板培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，其成分為：蛋 白胨8~12g、牛肉粉4~6g、氯化鈉4~6g，其余為水，pH值為7. 0~7. 5 ;平板培養(yǎng)基成分還包括 瓊脂粉16~20g。
[0023] 所述的B步驟中所述搖床的轉(zhuǎn)速為100~110r/min。
[0024] 所述的C步驟中發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，投料量為發(fā)酵罐的70~80%。
[0025] C步驟中發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵溫度為28~32°C，壓強(qiáng)為0.05MPa，攪拌速度為 170~190r/min，培養(yǎng)時(shí)間為 48h。
[0026] 所述的D步驟中吸附劑為硅藻土、草炭、發(fā)酵后的油枯或活性炭的一種或幾種，吸 附劑的粒徑為l~5mm。
[0027] 本發(fā)明的應(yīng)用為所述菌劑直接施入土壤，起到解磷、解鉀、提高土壤速效氮的作 用。
[0028] 下面通過實(shí)施例加以說明： 實(shí)施例1 --以放射根瘤菌A32為活性成分的制劑的制備 取在營養(yǎng)肉湯平板上培養(yǎng)好的放射根瘤菌紀(jì)A32接種到裝有營養(yǎng)肉湯 液體培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-110轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)60小時(shí)后，按10% 的接種量再轉(zhuǎn)接到裝有液體培養(yǎng)液的組培蘭花瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-110轉(zhuǎn)/分的搖床上培 養(yǎng)72小時(shí)后，用2倍體積粒徑為1-5_的草炭進(jìn)行吸附，形成固體菌劑型。
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