一種無血清培養(yǎng)基及其配制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種無血清培養(yǎng)基及其配制方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]無血清培養(yǎng)基是指不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基，可以應(yīng)用于培養(yǎng)免疫細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(例如，T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)、樹突狀細(xì)胞(也稱DC細(xì)胞)、單核/巨噬細(xì)胞等。
[0003]通常來說，免疫細(xì)胞在體外存活和擴(kuò)增所需要的營養(yǎng)物質(zhì)包括:白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、氨基酸、維生素、糖、脂質(zhì)、無機(jī)鹽、生長因子等。這些成分中，白蛋白對細(xì)胞生長和存活的影響最大，也是功能和組成最復(fù)雜的成分。而無血清培養(yǎng)基中，白蛋白所發(fā)揮的功能主要是由它所攜帶的脂肪酸和微量元素等成分決定的。
[0004]不同來源的白蛋白，例如不同種屬的牛白蛋白和人白蛋白，它們所攜帶的脂肪酸差異很大；例如，重組白蛋白與人血白蛋白所攜帶的脂肪酸不同；例如在重組白蛋白中，水稻胚乳提取的與酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)的重組白蛋白所攜帶的脂肪酸不同；不同產(chǎn)地的，也有不同。另外，后期生產(chǎn)加工過程也會造成白蛋白所攜帶的脂肪酸差異，例如不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的、不同的批次的白蛋白所攜帶的脂肪酸也有很大的不同?？傊?，以上這些差異就導(dǎo)致添加了白蛋白的無血清培養(yǎng)基的成分復(fù)雜、不穩(wěn)定。
[0005]無血清培養(yǎng)基中添加的白蛋白，其所攜帶的脂肪酸被細(xì)胞攝取后，用于構(gòu)建細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)化成能量、或者參與其它物質(zhì)的合成等。因此，培養(yǎng)基中的白蛋白所攜帶的脂肪酸的差異會影響到免疫細(xì)胞的生長增殖、細(xì)胞功能等各個(gè)方面。特別是，往往某些脂肪酸含量過高或過低也會不利于免疫細(xì)胞的增殖及其殺傷活性，比如過高含量的亞麻酸或過低含量的亞油酸對免疫細(xì)胞增殖和殺傷活性不利。
[0006]特別是，對于淋巴細(xì)胞來說，體外富集、活化，并擴(kuò)增淋巴細(xì)胞，可用于回輸治療多種諸如惡性腫瘤、感染、自身免疫病的疾病。然而，在體外擴(kuò)增的過程中，需要用到適宜體外支持淋巴細(xì)胞存活和擴(kuò)增的培養(yǎng)基。
[0007]目前，一些文獻(xiàn)公開了一些無血清培養(yǎng)基，例如適合培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，但都沒有公開針對白蛋白的組成復(fù)雜性的解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明提供了一種成分更穩(wěn)定的無血清培養(yǎng)基及其配制方法，改善了因白蛋白的組成復(fù)雜性而導(dǎo)致的培養(yǎng)基成分不穩(wěn)定的情況。
[0009]本發(fā)明一方面提供了一種無血清培養(yǎng)基的配制方法，所述無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和適用于所述無血清培養(yǎng)基的血清替代物，所述血清替代物包括白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和膽固醇，該配制方法包括以下步驟:步驟一，獲取無脂肪酸白蛋白；步驟二，將脂肪酸負(fù)載到所述無脂肪酸白蛋白上以獲得白蛋白溶液；步驟三，配制無血清培養(yǎng)基:將步驟二所獲得白蛋白溶液，以及除白蛋白以外的其他血清替代物溶解到所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以獲得無血清培養(yǎng)基。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟二中，將特定的脂肪酸負(fù)載到所述無脂肪酸白蛋白上；所述特定的脂肪酸包含棕櫚酸和/或硬脂酸、油酸和亞油酸；所述步驟二中，按照每Immol無脂肪酸白蛋白添加0.l-2mmol的棕櫚酸和/或硬脂酸，0.l-2mmol的油酸和0.l-2mmol的亞油酸的比例，將所述特定的脂肪酸添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液中混合，以獲得白蛋白溶液。
[0011]優(yōu)選的，所述特定的脂肪酸還包含花生四烯酸，所述花生四烯酸與所述亞油酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0012]優(yōu)選的，所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和硬脂酸、油酸和亞油酸，所述硬脂酸與所述棕櫚酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0013]優(yōu)選的，步驟二中，將所述特定的脂肪酸用無水乙醇溶解后，再添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液，在0-37.5°C攝氏度的條件下，攪拌混合達(dá)4小時(shí)以上。
[0014]優(yōu)選的，步驟三中，按照每IL基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.015?0.15mmol白蛋白的比例，將步驟二所獲得的白蛋白溶液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
[0015]優(yōu)選的，采用樹脂吸附或活性炭吸附的方法將白蛋白上所攜帶的脂肪酸去除，以獲得無脂肪酸白蛋白。
[0016]優(yōu)選的，所述的白蛋白為牛血清白蛋白、人血白蛋白或重組人血白蛋白。
[0017]優(yōu)選的，所述的重組人血白蛋白為水稻胚乳表達(dá)的重組人血白蛋白或者轉(zhuǎn)基因酵母菌表達(dá)的重組人血白蛋白。
[0018]其中，植物源重組人血白蛋白是指利用基因重組技術(shù)在植物中表達(dá)的人血白蛋白，例如，武漢禾元生物科技有限公司生產(chǎn)的重組人血白蛋白(OsrHSA);轉(zhuǎn)基因酵母菌表達(dá)的重組人血白蛋白是指利用基因重組技術(shù)在酵母菌中表達(dá)的人血白蛋白，例如，華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的重組人血白蛋白。
[0019]優(yōu)選的，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白的添加量為I?100mg/L，所述胰島素的添加量為I?100mg/L，所述膽固醇的添加量為I?10mg/Lo
[0020]優(yōu)選的，所述血清替代物還包含乙醇胺，其添加量為I?10mg/L，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)。
[0021]優(yōu)選的，步驟三中，將所述無血清培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到6.8?7.5之間。
[0022]本發(fā)明另一方面還提供了一種無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和適用于所述無血清培養(yǎng)基的血清替代物，所述血清替代物包含白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和膽固醇，所述白蛋白是通過在無脂肪酸白蛋白上負(fù)載脂肪酸而形成的。
[0023]優(yōu)選的，所述白蛋白是通過在無脂肪酸白蛋白上負(fù)載特定的脂肪酸而形成的；所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和/或硬脂酸、油酸和亞油酸；按照每Immol無脂肪酸白蛋白添加0.l-2mmol的棕櫚酸和/或硬脂酸，0.l_2mmol的油酸和0.l_2mmol的亞油酸的比例，將所述特定的脂肪酸添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。
[0024]優(yōu)選的，所述特定的脂肪酸還包括花生四烯酸，所述花生四烯酸與所述亞油酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0025]優(yōu)選的，所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和硬脂酸、油酸和亞油酸，所述硬脂酸與所述棕櫚酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0026]優(yōu)選的，所述無血清培養(yǎng)基中，所述白蛋白的添加量為0.015?0.15mmol/L，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)。
[0027]優(yōu)選的，所述的白蛋白為牛血清白蛋白、人血白蛋白或重組人血白蛋白。
[0028]優(yōu)選的，所述的重組白蛋白為水稻胚乳表達(dá)的重組人血白蛋白或者轉(zhuǎn)基因酵母菌表達(dá)的重組人血白蛋白。
[0029]優(yōu)選的，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白的添加量為I?100mg/L，所述胰島素的添加量為I?100mg/L，所述膽固醇的添加量為I?10mg/Lo
[0030]優(yōu)選的，所述血清替代物還包含乙醇胺，其添加量為I?10mg/L，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)。
[0031]優(yōu)選的，所述無血清培養(yǎng)基的pH值為6.8?7.5。
[0032]本發(fā)明再一方面還提供了上述的配制方法所配制的無血清培養(yǎng)基或者上述的無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)免疫細(xì)胞方面的應(yīng)用。
[0033]優(yōu)選的，所述的免疫細(xì)胞為淋巴細(xì)胞或DC細(xì)胞。
[0034]優(yōu)選的，所述的淋巴細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞。
[0035]本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基配制方法，將脂肪酸負(fù)載到無脂肪酸白蛋白上后，再將獲得的成分穩(wěn)定的白蛋白溶液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，由此獲得的無血清培養(yǎng)基成分更穩(wěn)定，功能一致性更好，不會因白蛋白的種屬來源或加工批次的差異有所不同。
【附圖說明】
[0036]圖1為實(shí)施例1?4的無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖能力的結(jié)果；
[0037]圖2為對比例I?4的無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖能力的結(jié)果；
[0038]圖3為實(shí)施例1?11與對比例5?7的無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖能力的結(jié)果；
[0039]圖4為實(shí)施例1?11與對比例5?7的無血清培養(yǎng)基的淋巴毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；
[0040]圖5為實(shí)施例2與對比例5?7的無血清培養(yǎng)基的DC細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些【具體實(shí)施方式】。
[0042]實(shí)施例1?4
[0043]實(shí)施例1?4的無血清培養(yǎng)基的配制過程如下:
[0044]步驟一:獲取無脂肪酸白蛋白；
[0045]實(shí)施例1取牛血清白蛋白(購自SIGMA公司的A1933產(chǎn)品)1.5mmol，加注射用水配成2000ml溶液，加入50g活性炭，混勻；采用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH值到pH3.0 ;置于56°C水浴中30分鐘或4°C放置過夜；離心處理(4000轉(zhuǎn)/分鐘)去除活性炭；再用2mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值到pH7.0 ;最后過濾除菌獲得實(shí)施例1的無脂肪酸白蛋白溶液；
[0046]實(shí)施例2取人血白蛋白(購自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(產(chǎn)品規(guī)格為20% 50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過5mol/mol白蛋白))1.5mmol，具體操作過程同實(shí)施例1，獲得實(shí)施例2的無脂肪酸白蛋白溶液；
[0047]實(shí)施例3取人血白蛋白(購自武漢生物制品研宄所有限責(zé)任公司的人血白蛋白(產(chǎn)品規(guī)格20% 50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過10mol/mol白蛋白))1.5mmol，具體操作過程同實(shí)施例1，獲得實(shí)施例3的無脂肪酸白蛋白溶液；
[0048]實(shí)施例4