一種耐高溫木聚糖酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶基因改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫木聚糖酶突變體及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖（xylan)廣泛存在于自然界中，是半纖維素的重要組分，它是自然界中含 量?jī)H次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機(jī)碳含量的三分之一。在被 子植物中木聚糖占干物質(zhì)重的15% -30%，在裸子植物中占干物質(zhì)重的7% -12%。但木 聚糖具有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，在動(dòng)物的消化道內(nèi)不能被消化和吸收，而且會(huì)影響其它養(yǎng)分 的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖飼料（大麥、小麥、黑麥等）的應(yīng)用。木聚糖酶 (Xylanase)是指能專(zhuān)一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱(chēng)。人們對(duì)木 聚糖酶的研宄早在六十年代就已開(kāi)始，主要研宄集中在食品、飼料、造紙、能源工業(yè)等方面 的木聚糖酶，已經(jīng)從不同來(lái)源的微生物中分離到大量的不同類(lèi)型不同功能的木聚糖酶。并 分離出多種木聚糖酶基因，已工業(yè)化生產(chǎn)多種木聚糖酶產(chǎn)品。
[0003] 因?yàn)槟壳霸陬w粒生產(chǎn)過(guò)程中有一個(gè)短暫的80-90°C的高溫階段。青霉菌來(lái)源木聚 糖酶熱穩(wěn)定性較差，其水溶液在65°C下保溫5分鐘剩余酶活性低于30%，使該酶在顆粒飼 料的應(yīng)用受到限制。采用飼料制粒后木聚糖酶液體噴涂到飼料上的方法不僅增加設(shè)備投 入，而且對(duì)酶制劑的穩(wěn)定性、飼料中分布均一性都無(wú)法很好的保證。因此，提高木聚糖酶熱 穩(wěn)定性對(duì)目前飼料用木聚糖酶具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種耐高溫木聚糖酶突變體及其在飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明通 過(guò)對(duì)來(lái)源于繩狀青霉（Penicillium funiculosum)的木聚糖酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，獲得 了突變體蛋白，其耐熱性得到顯著提高，有利于其在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
[0005] 申請(qǐng)人通過(guò)對(duì)來(lái)源于繩狀青霉的木聚糖酶進(jìn)行大量突變的篩選，發(fā)現(xiàn)N34C、 S103Y、T175C、S184C和T187C這五個(gè)突變位點(diǎn)能引起木聚糖酶耐熱性的提高，從而促成本 發(fā)明。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :1的木聚 糖酶的第103位氨基酸由Ser變?yōu)門(mén)yr。
[0007] 上述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :4〇
[0008] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :4的木聚糖酶突變體的質(zhì)粒。
[0009] 本發(fā)明一方面提供了另一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :3的木 聚糖酶的第175位氨基酸由Thr變?yōu)镃ys，第184位氨基酸由Ser變?yōu)镃ys。
[0010] 上述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :5,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :6〇
[0011] 本發(fā)明還提供攜帶編碼序列為SEQ ID NO :6的突變體基因的質(zhì)粒。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種木聚糖酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :3的木聚糖酶 的第34位氨基酸由Asn變?yōu)镃ys，第187位氨基酸由Thr變?yōu)镃ys。
[0013] 所述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :7,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO :8〇
[0014] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :8的突變體基因的質(zhì)粒。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，包含攜帶有木聚糖酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0016] 所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為畢赤酵母（Pichia pastoris)。
[0017] 本發(fā)明提供的野生型木聚糖酶XynPF在65°C條件下處理5min后僅殘留28%左右 的酶活，在75°C、80°C條件下處理5min后酶活殘留率幾乎為0 ;而含S103Y單點(diǎn)突變的木聚 糖酶突變體XynTl在65°C條件下處理5min后能保持50%以上的酶活，在75°C、80°C條件下 處理5min后仍能分別保持35%、30%的酶活；而含S103Y/T175C/S184C三點(diǎn)突變的木聚糖 酶突變體XynT3. 1和含S103Y/N34C/T187C三點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體XynT3. 2在65°C條 件下處理5min后均能保持90%以上的酶活，且在75°C、80°C條件下處理5min后仍能分別 保持45%、35%左右的酶活。此外，與野生型相比，本發(fā)明篩選到的木聚糖酶突變體XynTl， XynT3. 1和XynT3. 2的最適作用pH值未發(fā)生變化，仍為5. 5,但其耐熱性均得到顯著提高， 因此更適合在飼料中的廣泛應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】：
[0018] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn) 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載 的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體 實(shí)施例的限定。
[0019] 實(shí)驗(yàn)材料和試劑：
[0020] 菌株與載體：大腸桿菌DH5a、畢赤酵母GS115、載體pPIC9k、Amp、G418購(gòu)自 Invitrogen 公司。
[0021] 酶與試劑盒：PCR酶及連接酶購(gòu)買(mǎi)自Takara公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas 公司，質(zhì)粒提取試劑盒及膠純化回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，GeneMorph II隨機(jī)誘變?cè)噭?盒購(gòu)自北京博邁斯生物科技有限公司。
[0022] 培養(yǎng)基配方：
[0023] 大腸桿菌培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：0. 5%酵母提取物，1%蛋白胨，1% NaCL，pH7. 0);
[0024] LB-AMP培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基加100 μ g/mL氨芐青霉素；
[0025] 酵母培養(yǎng)基（YH)培養(yǎng)基）：1%酵母提取物、2%蛋白胨2%葡萄糖；
[0026] 酵母篩選培養(yǎng)基（MD培養(yǎng)基）：2%蛋白胨、2%瓊脂糖；
[0027] BMGY培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸鉀緩沖液（pH6.0)，l.34% YNB，4X10-5生物素，1 %甘油；
[0028] BMMY培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸鉀緩沖液（pH6.0)，l.34% YNB，4X10-5 生物素，0. 5% 甲醇。
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0030] 實(shí)施例1木聚糖酶基因的擴(kuò)增
[0031] 為了從繩狀青霉中擴(kuò)增得到木聚糖酶基因，設(shè)計(jì)PCR引物XynPF-Fl、XynPF-Rl如 下：
[0032] XynPF-FI ：GCTGTTACATCCAACGAGACCGG
[0033] XynPF-Rl ：TTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG
[0034] 以該繩狀青霉基因組為模板，以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，連接 pEASY-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，挑取正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子 編碼的木聚糖酶命名為XynPF，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1，核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0035] 實(shí)施例2木聚糖酶突變體基因的擴(kuò)增及合成
[0036] 為了提高木聚糖酶XynPF的耐熱性，通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行了大量突變的 篩選，設(shè)計(jì)PCR引物XynPF-F2、XynPF-R2如下：
[0037] XynPF-F2 ：GGCGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCGG (下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶 EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)）；
[0038] XynPF-R2 ：ATAGCGGCCGCTTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG(下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶 NotI 識(shí)別位點(diǎn)）；
[0039] 以XynPF基因?yàn)槟０?，以上述引物用GeneMorph II隨機(jī)突變PCR試劑盒 (Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、NotI進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切 后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養(yǎng)， 待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加入150ul含有0.1 mM IPTG的LB+Amp 培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含 有木聚糖酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0040] 分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊于75°C處理5min后，兩塊96 孔板都加入30ul底物，于37°C反應(yīng)30min后，DNS法測(cè)定生成的還原糖，不同的突變子高 溫處理后保持的活性不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有些突變對(duì)木聚糖酶的耐熱性沒(méi)有影響，有些突 變甚至使其耐熱性或酶活變得更差了；另外還有些突變，雖然能提高木聚糖酶對(duì)溫度的耐 受性，但突變后其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生了顯著的變化，這些均不符合要求。最終，申請(qǐng)人篩選到既 能顯著提高木聚糖酶的耐熱性，又不會(huì)影響其酶活及原有酶學(xué)性質(zhì)的突變位點(diǎn)及位點(diǎn)的組 合：S103Y單點(diǎn)突變體以及S103Y/T175C/S184C和S103Y/N34C/T187C兩個(gè)三點(diǎn)突變體。 [0041] 含S103Y單點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體，命名為XynTl，其氨基酸序列為SEQ ID NO : 3,編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
[0042] 含S103Y、T175C和S184C的三點(diǎn)突變體，命名為XynT3. 1，其氨基酸序列為SEQ ID NO :5,編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
[0043] 含S103Y、N34C和T187C的三點(diǎn)突變體，命名為XynT3. 2,其氨基酸序列為SEQ ID NO :7,編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :8。
[0044] 上述核苷酸序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :8由上海捷瑞生物公 司合成。
[0045] 用引物XynPF-F2、XynPF-R2對(duì)上述三個(gè)突變體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物兩端引入EcoR I、