酶的自然變異體的獲取方法及超耐熱性纖維二糖水解酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶的自然變異體的獲取方法，以及通過(guò)該方法獲得的超耐熱性纖 維二糖水解酶（celIobiohydrolase)。
[0002] 本申請(qǐng)要求2014年3月13日在日本提出的特愿2014-050083號(hào)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)， 并將其內(nèi)容引用在本申請(qǐng)中。
【背景技術(shù)】
[0003] 在地球上存在有豐富的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，人們期待以將其作為原料的乙醇等生 物燃料來(lái)替代化石燃料成為運(yùn)輸用能源。將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)變成乙醇，需要纖維素、半纖維素 的糖化。在纖維素糖化中，有硫酸糖化和酶糖化兩種方法。通常，基于統(tǒng)稱(chēng)為纖維素酶的糖 苷水解酶的糖化與硫酸糖化相比，具有不產(chǎn)生硫酸淤渣、能源投入量少以及不會(huì)引起過(guò)分 解、收率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 另一方面，構(gòu)成植物細(xì)胞壁的纖維素，其具有相互由堅(jiān)固的氫鍵連接的結(jié)晶結(jié)構(gòu)， 因此幾乎不溶于水，基于酶的纖維素水解為固液反應(yīng)。固液反應(yīng)是在固體表面上進(jìn)行結(jié)晶 性纖維素的水解，因此，基于酶的糖化效率非常低。例如，作為主要的纖維素水解酶的纖維 二糖水解酶（CBH)與其它多糖類(lèi)分解酶相比，水解速度要慢一位數(shù)至兩位數(shù)左右，因此，纖 維素生物質(zhì)的糖化需要大量的酶，這形成纖維素類(lèi)生物燃料的主要的成本因素。為了降低 纖維素乙醇的成本，需要格外提高纖維素酶的糖化效率。
[0005] 提尚酶效率的一種方法為提尚酶蛋白質(zhì)的耐熱性。為了提尚酶蛋白質(zhì)的耐熱性， 人們嘗試了隨機(jī)替換氨基酸序列的定向進(jìn)化（directed evolution，DE)法、限定特定部位 進(jìn)行氨基酸取代的定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis，SDM)法、將多個(gè)基因在多處進(jìn) 行切斷并通過(guò)改組制成嵌合序列的方法等導(dǎo)入氨基酸變異的各種酶的改良方法。
[0006] 基于DE法的酶改性在理論上效率極差。其原因在于伴隨點(diǎn)突變的數(shù)量，變異體的 數(shù)量呈天文數(shù)字級(jí)增長(zhǎng)，即會(huì)產(chǎn)生"組合爆炸問(wèn)題"。若想得到最適合的氨基酸排列，則需要 針對(duì)全部氨基酸殘基的組合制作突變體庫(kù)并進(jìn)行功能檢驗(yàn)，這在原理上是不可能的。此外， 突變的大部分幾乎為喪失功能的功能不全型（loss of function)，獲得中立突變或有利的 功能的功能獲得型（gain of function)十分稀有，基于DE法的最優(yōu)選氨基酸序列的探索 效率差。
[0007] 由于必須對(duì)龐大數(shù)量的突變體庫(kù)進(jìn)行篩查才能獲得有效的突變體、沒(méi)有有效的高 通量（high-throughput)篩查法或穩(wěn)定基因表達(dá)系統(tǒng)等原因（例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1。）， 該基于DE法的纖維素酶的功能改良無(wú)法充分進(jìn)行。
[0008] 例如，中澤等提出了將木材腐朽菌里氏木霉（Trichoderma reesei)的內(nèi)切葡聚糖 酶EGIII通過(guò)DE法進(jìn)行改良的報(bào)告（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。該EGIII為由218氨基酸殘基 構(gòu)成的具有比較小的分子量的蛋白質(zhì)。但是，即使是這種小的蛋白質(zhì)，任意一處發(fā)生氨基酸 取代引起的突變?cè)斐傻淖儺愺w數(shù)量為4, 360種（20X218)、任意兩處突變?cè)斐傻淖儺愺w數(shù) 量為946萬(wàn)種（20 X 20 X 218 X 217 + 2)，更進(jìn)一步地，任意三處突變?cè)斐傻淖儺愺w數(shù)量發(fā)生 爆炸性組合，為 136 億 2413 萬(wàn)種（20 X 20 X 20 X (218X217X216 + 6))。
[0009] 只是獲得兩三處變異的變異體，就需要制作數(shù)千萬(wàn)~數(shù)百億個(gè)的突變庫(kù)及其功能 篩查，這并不現(xiàn)實(shí)。中澤等人對(duì)第一代及第二代共11，〇〇〇個(gè)突變體個(gè)體進(jìn)行了功能篩查， 但僅限于將最適溫度作了+5°C的改善，并未實(shí)現(xiàn)耐熱性的大幅提高。若突變體庫(kù)的規(guī)模小， 顯然無(wú)法發(fā)現(xiàn)有效的變異體。此外，在進(jìn)行功能篩查的第一代突變庫(kù)9, 000個(gè)群落中，只獲 得了 46個(gè)具有CMC水解活性的變異體群落。8, 954個(gè)殘余的突變體被認(rèn)為是氨基酸變異導(dǎo) 致的功能喪失或基因的表達(dá)不全，因 DE法的誤差（error) PCR引發(fā)的隨機(jī)突變大部分都導(dǎo) 致了酶蛋白質(zhì)的功能喪失。如此，DE法由于產(chǎn)生大量的功能喪失變異體，因此篩查效率非 常差。
[0010] 基因改組法，迄今為止還無(wú)法獲得在耐熱性上超過(guò)親本基因的嵌合基因。例如， Heinzelman等人提出，在多處切斷多個(gè)纖維二糖水解酶基因，通過(guò)改組制成嵌合基因，以謀 求酶功能的改善的方法（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。根據(jù)該方法，以提高里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖 酶CBH II的耐熱性為目的，通過(guò)基因改組將嗜熱絲狀菌特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens) 與嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermopHilum)的CBH II酶基因進(jìn)行組合，制作嵌合酶，但所 述嵌合酶的耐熱性未超過(guò)作為親本的嗜熱絲狀菌嗜熱毛殼菌的CBH II，無(wú)法獲得有效的基 因改組效果。
[0011] 相對(duì)于靠隨機(jī)突變的氨基酸取代的DE法，SDM法則為根據(jù)酶蛋白質(zhì)的三維立體結(jié) 構(gòu)數(shù)據(jù)而引發(fā)氨基酸取代、缺失或插入等突變的方法。雖然不需要DE法那樣龐大的突變體 篩查，但一般情況下難以預(yù)測(cè)出與提高酶功能相關(guān)的部位的確定，通過(guò)SDM法而使纖維素 酶功能得到顯著改善的例子并不多。
[0012] 例如，纖維二糖水解酶在N末端和C末端上分別有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形成覆蓋活性中心的 洞形（tunnel)結(jié)構(gòu)。人們著眼于該結(jié)構(gòu)，正在嘗試取代環(huán)內(nèi)的氨基酸的SDM法。在張等 人的報(bào)告中指出，他們嘗試推算出嗜熱放線菌（Thermobifida fusca)的纖維二糖水解酶 TfCe 16B的三維立體結(jié)構(gòu)，在形成活性部位的洞狀結(jié)構(gòu)的N末端、C末端的環(huán)上通過(guò)雙重突 變導(dǎo)入二硫鍵，提高耐熱性，但是與期待相反，所得變異體的酶活性的半衰期溫度T 5tl減少 了 l〇°C (參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。張等人進(jìn)一步將四處的甘氨酸殘基取代為丙氨酸、絲氨酸、 脯氨酸，但均未獲得因突變而使耐熱性得到提高的纖維二糖水解酶，大部分的突變體的耐 熱性都降低了 5~10°C。
[0013] 此外，沃爾法特等人的報(bào)告中指出，他們?yōu)榱颂岣邔儆诮z狀菌T. reesei的GH6家 族的纖維二糖水解酶TfCe 16A的熱穩(wěn)定性，在N末端環(huán)及C末端環(huán)上和位于其附近的氨基 酸殘基上加入變異，制備變異體，該變異體雖然在PH7.0下熱變性溫度（Tm)上升，但在野生 型TfCe 16A的最適pH，即pH5.0下，Tm值反而變差（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。另一方面，馮?奧 斯托夫斯基（Von ostrowski)等人為了使形成屬于絲狀菌T. reesei的GH7家族的纖維二 糖水解酶TfCe 17A活性中心的洞狀環(huán)的exo-loop結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，在所述環(huán)內(nèi)導(dǎo)入SS (二硫） 鍵而制作變異體，但未確認(rèn)出所述變異體有任何熱穩(wěn)定性的改善（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。如 此，在形成認(rèn)為與纖維二糖水解酶酶功能密切相關(guān)的環(huán)結(jié)構(gòu)的C末端環(huán)上，進(jìn)行了多次導(dǎo) 入氫鍵或SS鍵的嘗試，但迄今為止，耐熱性的提高等、酶功能改善并不成功。
[0014] 若對(duì)相同的基因進(jìn)行生物種間比較，則可知具有充分保存的區(qū)域和頻繁進(jìn)行氨基 酸變異的區(qū)域，該保存區(qū)域?yàn)橘x予特定范疇的蛋白質(zhì)特征的共通的序列，因此被稱(chēng)為"共用 序列"。該共用序列中的氨基酸殘基若變異則為易失去酶功能的部位，因此其能在漫長(zhǎng)進(jìn)化 過(guò)程中得到良好保存。因此，在共用序列發(fā)生氨基酸變異引起突變，功能喪失的可能性高。 在此，人們嘗試了避開(kāi)共用序列而加入突變的SDM法。但是，能適用該方法的僅限于通過(guò)X 射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析等來(lái)確定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的酶，而這種明確了三維結(jié)構(gòu)的酶蛋白質(zhì)很 少。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0016] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0017] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1]Himmel，et al.，Current Opinion in Biotechnology，1999， vol. 10, p. 358 ~364 ;
[0018] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2]Nakazawa，et al.，Applied Microbiology and Biotechnology， 2009, vol. 83, p. 649 ~657 ;
[0019] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3] Heinzelman， et al. ?Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009,vol. 106,p.5610 ~5615;
[0020] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4] Zhang，et al.，European Journal of Biochemistry，2〇00， vol. 267, p. 3101 ~3115 ;
[0021] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5] Wohlfahrt，et al.，Biochemistry，2003，vol. 42，ρ· 10095 ~ 10103 ；
[0022] [非專(zhuān)利文獻(xiàn) 6] Von Ossowski，et al.，Journal of Molecular Biology，2003， vol. 333, p. 817 ~829。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0024] 本發(fā)明的目的在于，提供一種高效地獲取功能獲得型變異體的方法。
[0025] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的在于，提供一種由上述方法獲得的新型超耐熱性纖維 二糖水解酶、編碼所述超耐熱性纖維二糖水解酶的多聚核苷酸、用于表達(dá)所述超耐熱性纖 維二糖水解酶的表達(dá)載體、編入了所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，以及使用所述超耐熱性纖維二 糖水解酶的纖維素分解物的制備方法。
[0026] 解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)手段
[0027] 本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題，經(jīng)認(rèn)真研宄后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用由高溫土壤中所含的 微生物菌叢的宏基因組DNA中分離出的纖維二糖水解酶的堿基序列設(shè)計(jì)的引物，對(duì)高溫 土壤微生物菌叢的宏基因組DNA，實(shí)施多個(gè)，例如300個(gè)以?xún)?nèi)的群落PCR，伴隨多個(gè)氨基 酸的取代，或能夠獲取具有包含靜態(tài)（silent)的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的多個(gè)超耐熱性纖維二糖水解酶活性的自然變異體，從而完成了本發(fā) 明。
[0028] 此外，本發(fā)明中的"自然變異體"，是指通過(guò)人為手段產(chǎn)生的突變體以外的一切突 變體。
[0029] "超耐熱性"是指酶活性的最適溫度或酶蛋白質(zhì)的熱變性溫度為80°C以上。
[0030] 即，作為本發(fā)明涉及的酶的自然變異體的獲取方法、酶的變異體的制備方法、超耐 熱性纖維二糖水解酶、編碼所述超耐熱性纖維二糖水解酶的多聚核苷酸、用于表達(dá)所述超 耐熱性纖維二糖水解酶的表達(dá)載體、編入所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體、超耐熱性纖維二糖水解 酶的制備方法、纖維素酶混合物及纖維素分解物的制備方法，可列舉為如下[1]~[13]。
[0031] [1] 一種選擇性地獲取具有活性的酶的自然變異體的方法，該方法包括以下工 序：
[0032] (1)從由環(huán)境微生物菌叢宏基因組DNA的堿基序列組成的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢測(cè) 具有酶活性的蛋白質(zhì)ORF(以下也稱(chēng)作開(kāi)放閱讀框）序列的工序；
[0033] (2)使用基于該ORF序列而設(shè)計(jì)的引物，對(duì)至少一個(gè)環(huán)境微生物菌叢宏基因組DNA 進(jìn)行PCR克隆，獲得至少一個(gè)由該ORF序列的全長(zhǎng)、該ORF序列的部分序列、或編碼該ORF 序列所編碼的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的堿基 序列所組成的PCR克隆的工序；
[0034] (3)對(duì)在所述工序（2)中得到的各PCR克隆，確定堿基序列及該堿基序列所編碼的 氨基酸序列的工序；
[0035] (4)測(cè)定在所述工序（2)中得到的各PCR克隆所編碼的蛋白質(zhì)的酶活性，選擇具有 活性的酶的自然變異體的工序。
[0036] [2] -種具有活性的酶的變異體的制備方法，該方法包括以下工序：
[0037] (1)從由環(huán)境微生物菌叢宏基因組DNA的堿基序列組成的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢測(cè) 具有酶活性的蛋白質(zhì)ORF序列的工序；
[0038] (2)使用基于該ORF序列而設(shè)計(jì)的引物，對(duì)至少一個(gè)環(huán)境微生物菌叢宏基因組DNA 進(jìn)行PCR克隆，獲得至少一個(gè)由該ORF序列的全長(zhǎng)、該ORF序列的部分序列、或編碼該ORF 序列所編碼的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的堿基 序列所組成的PCR克隆的工序；
[0039] (3)對(duì)在所述工序（2)中得到的各PCR克隆，確定堿基序列及該堿基序列所編碼的 氨基酸序列的工序；
[0040] (4)測(cè)定在所述工序⑵中得到的各PCR克隆所編碼的蛋白質(zhì)的酶活性的工序；
[0041] (5)在所述工序（3)及所述工序（4)后，考察所述ORF序列編碼的氨基酸序列的差 異與所述酶活性的關(guān)系的工序；
[0042] (6)基于所述工序（5)中得到的氨基酸序列的差異與酶活性的關(guān)系性，通過(guò)使所 述ORF序列編碼的氨基酸序列至少缺失、取代或添加一個(gè)氨基酸殘基，從而制備所述酶活 性得到提高的變異體的工序。
[0043] [3]上述[2]所述的酶的變異體的制備方法，其中，所述環(huán)境微生物菌叢的宏基因 組DNA為來(lái)自高溫土壤的宏基因組DNA，所述酶為至少在70°C以上顯示酶活性的耐熱性酶。
[0044] [4]上述[2]或[3]所述的酶的變異體的制備方法，其中，所述酶為纖維素酶。
[0045] [5] -種具有纖維二糖水解酶催化劑區(qū)域的超耐熱性纖維二糖水解酶，其中，該纖 維二糖水解酶催化劑區(qū)域由下述組成：
[0046] (A)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列所組成的多肽；
[0047] (B)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一個(gè)氨基酸殘 基（除了缺失、取代或添加了一個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列中的88位的絲氨酸、230位的苯 丙氨酸、414位的絲氨酸）的氨基酸序列所組成，且至少在80°C、pH5. 5的條件下具有纖維 二糖水解酶活性的多肽；
[0048] (C)由與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的氨基酸序 列（88位為絲氨酸，230位為苯丙氨酸，414位為絲氨酸）所組成，且至少在80°C、pH5. 5的 條件下具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
[0049] [6] -種含有對(duì)纖維二糖水解酶催化劑區(qū)域進(jìn)行編碼的區(qū)域的多聚核苷酸，其中， 所述對(duì)纖維二糖水解酶催化劑區(qū)域進(jìn)行編碼的區(qū)域由下述組成：
[0050] (a)對(duì)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列所組成的多肽進(jìn)行編碼的堿基序列；
[0051] (b)對(duì)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一個(gè)氨基酸 殘基（除了缺失、取代或添加了一個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列中的88位的絲氨酸、230位的 苯丙氨酸、414位的絲氨酸）的氨基酸序列所組成且至少在80°C、pH5. 5的條件下具有纖維 二糖水解酶活性的多肽進(jìn)行編碼的堿基序列；
[0052] (c)對(duì)由與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的氨基酸 序列（88位為絲氨酸，230位為苯丙氨酸，414位為絲氨酸。）所組成且至少在80°C、pH5. 5 的條件下具有纖維二糖水解酶活